الموضوع: إستخدام تقنية PCR في الكشف عن Streptococcus agalactiae في الحليب

إستخدام تقنية PCR في الكشف عن Streptococcus agalactiae في الحليب

المقدمة

يعتبر إلتهاب الضرع السريري السبب الرئيسي للخسارة الإقتصاديةفي صناعة الألبان . حيث يعمل على خفض كمية و نوعية الحليب ، هذا بالإضافة إلى إرتفاع تكلفة الخدمات و الأدوية البيطرية المستخدمة في المعالجة . و تكمن خطورة هذا المرض بإعتباره مرض معدي ( إنتقاله من بقرة لأخرى عن طريق آلة الحلابة _ كؤوس الحلمة ) ما لم يتم تطبيق تدابير التطهير بشكل صحيح .

إن Streptococcus agalactiae هي العامل المسبب لهذا المرض . و بسبب كون هذا المرض سريري ، كما أن قابلية الإصابة عالية ، فمن المهم تشخيص وجود هذه البكتريا بشكل مبكر في الأبقار المصابة .

الطرق التقليدية لتمييز وجود هذه البكتريا ترتكز على زرع البكتريا عي بيئة آغار الدم ، حيث يسبب وجود هذه البكتريا في هذه البيئة إنحلال الدم . كما أن هذه البكتريا تشكل مستعمرات ملونة عندما تنمو على النشا .

كما أن بعض الطرق ترتكز على إستخدام مستضدات تحوي على بولي سكارايد و في هذه الحالة يستعمل في التشخيص الإختبار الكيميائي الحيوي .

و في الوقت الحاضر تستعمل أغشية بكترولوجية في كل عملية حلابة و تعتبر هذه من الطرق القياسية . لكن هذا غير كافي للكشف المبكر و كبديل تستخدم تقنيةPCR في الكشف عن بكتريا Streptococcus agalactiae في عينات الحليب.
هذه الدراسة إعتمدت على تضخيم DNA بواسطة 16S rRNA subunit

المواد و الطرائق

سلالات البكتريا المستخدمة

الجدول (1) يبين السلالات المستعملة في الدراسة


النمو الجرثومي و الإغناء الإنتقائي :
كل سلالات Str. agalactiae نميت في طبق آغار الدم ، يتم عد المستعمرات في الأطباق بعد التحضين على درجة حرارة 37 ْم لمدة 24 _48 ساعة .
ولزيادة الحساسية عينات الحليب التي تحوي Str. agalactiae يتم إغنائها بشكل إنتقائي، بإضافة 1 مل من عينة الحليب إلى 1 مل من بيئة
(Strep Select Broth (BP 212/100, ChaiLaboratory),
تمزج بلطف و تحضن ليلا على درجة خرارة 37 ْ م دون إهتزاز . بعد الإغناء يتم عزل DNA

عزل DNA
يتم عزل أو إنتزاع DNA بزرع جرثومي للمستعمرة بوجود الليزوزيم و بروتيازK
ثم يعامل بحمض الكربونيك ثم الكلوروفورم و كحول isoamy، و الإيتانولJersek et al. 1996).) .
DNA المنتزع من الحليب يتم الحصول عليه بالطريقة التالية :
1- نضع 1 مل من الحليب في أنبوب إختبار يثفل لمدة دقيقتين بجهاز تثفيل 14000دورة .
2- يتم التخلص من الطبقة الطافية
3- يغسل ب EDTA حتى الحصول على محلول واضح
4- الغسيل بمحلول PCR الموقي (100 ميكرولتر )
5- أضف الليزوزيم إلى التركيز النهائي ( 1 ملغ /مل )
6- إترك الأنبوب لمدة 15 –20 دقيقة على درجة حرارة الغرفة
7- أضف البروتياز K إلى التركيز النهائي ( 200ميكروغرام / مل )
8- حضن على درجة حرارة 56 ْ م لمدة 30 –60 دقيقة
9- التثفيل
10- الطبقة السائلة العليا تنقل لأنبوبة جديدة
و بهذا نحصل على DNA من عينة الحليب .
تصميم مبادئ القراءةPrimer

صمم مبادئا قراءة هما V1,V2 لتمييز Str. agalactiae . كما صمم مبادئات قراءة أخرى وظيفتهم تمييز الخطأ الناتج عن ظهور منتجات تضخيم بإستعمال V1,V2 في negatives ( العينات التي لا تحوي Str. agalactiae) و تسمى هذه المبادئات بمبادئات السيطرة .المجموعة الأولى من مبادئات السيطرة هما زوج المبادئات C1,C2 هذه المبادئات تتفاعل مع Streptococcus sppالموجودة بشكل طبيعي في الحليب الخام .
المجموعة الثانية من مبادئات السيطرة هما ,BMC1 BMC2 المحضرة من سلسلة ضمن الجين المعروف بـCytochrome-B genemitochondrial ، هذه البادئات تقوم بالتفاعل مع الخلايا الجسدية الموجودة في الحليب الخام بشكل طبيعي .

V1: 5′-TTTGGTGTTTACACTAGACTG-3′
V2: 5′-TGTGTTAATTACTCTTATGCG-3′
C1: 5′-GCGTGCCTAATACATGCAA-3′
C2: 5′-TACAACGCAGGTCCATCT-3′
BMC1: 5′-CGATACATACACGCAAACG-3′
BMC2: 5′-TGTTGGGTTGTTGGAGCC-3′

مواضيع مشابهة:

• [عرض]  فرصه رررائعه لمنتجي الحليب واصحاب مزارع انتاج الحليب بمصر
• انتاج الحليب السائل من الحليب البودره
• الفرق بين الخلية النباتية و الخلية الحيوانية
• الكشف عن طزاجة الحليب والتأكد من سلامته
• الكشف عن متبقيات المبيدات في الحليب الطازج

تفاعل PCR
يحتوي خليط التفاعل على 2.5 ميكرولتر من محلول PCR الموقي ( 1.5ميلي مول MgCl)؛ ا ميكرولتر من مبادئ القراءة العكسية ؛ 1 ميكرولتر من مبادئ القراءة الأمامي ؛ 0.2ميكرولتر من dNTP ؛ 0.1 ميكرولتر من أنزيم Taq polymerase ؛ 5 ميكرولتر من DNA ( 50- 100 نانوغ / ميكرولتر ) و يضاف ماء معقم إلى المزيج ليصبح الحجم الكلي 25 ميكرولتر .
إختبارات الحساسية
إختبارات الحساسية في تجربة PCR تتم كما يلي :
نقوم بعمل 10 تخافيف من مستعمرة بكتريا Str. agalactiae في محلول ملحي . من كل تركيز نأخذ ثلاث عينات : الأولى من أجل طبق العد ، و العينة الثانية للتشخيص الفوري بـPCR ، و الأخيرة لأجل الإغناء الإنتقائي الذي يعقبه تشخيص بـ PCR .
كلتا سلسلة الأنابيب المستخدمة للتشخيص ( الثانية و الثالثة ) تخضع لـ DNA المضخم بواسطة زوج مبادئات القراءة V1 ,V2.
تحدد الحساسيةبحساب عدد المستعمرات المنتجة للوحدات المرئية في أنبوب الإختبار ( ذو التخفيف الأعلى ) ، و ذلك لتحديد نواتج PCR الممكن الحصول عليها .
إختبار الحساسية الثاني يطبق لمعرفة قدرة هذه التقنية على تحديد حليب الأبقار المصابة ، و المضاف إلى حليب أبقار غير مصابة
العينات المخففة تخضع لإغناء يليه تشخيص بـ PCR .
الحساسية تحدد بعامل التخفيف في أنبوب الإختبار ( ذو التركيز الأعلى ) و الذي يمكنه تمييز مقدار نواتج PCR الممكن الحصول عليها .

النتائج

المنتجات المضخمةمن 16S rRNAلـ 11 نوع من Streptococcus رتبت و قورنت . فحص سلسلة الإلتحام كشف منطقتين رئيسيتين
المنطقة الأولى من الموقع 66 إلى الموقع 101 ، المنطقة الثانية من الموقع 183 إلى الموقع 210 . عند فحص سلسلة Str. agalactiae لهذه المناطق بينت أن Str. agalactiaeكانت مميزة و مختلفة عن سلالات Str الأخرى .
و قد وجد تطابق كامل في 16S rRNA لستة سلالات منS. agalactiaeمع تلك الموجودة في بنك الجينات
بالإضافة لذلك يوجد تطابق كامل لسلالات S. difficile

الشكل (3) يعرض نواتج التضخيم لسلالات Str. agalactiaeبالإضافة إلى سلالات أخرى من Streptococcus و سلالات من E. coli بإستعمال مبادئ القراءة V1,V2lanes 1 to7) ) ، و بإستعمال مبادئ القراءة C1,C2(lanes 9 to 15)



من الشكل نلاحظ أن ناتج التضخيم المستحصل عليه بإستعمال V1,V2 تم الحصول عليه مع Str. agalactiae، بينما نواتج التضخيم المستحصل عليها بواسطةC1-C2 تم الحصول عليها مع كل سلالات Streptococcus لكن ليس مع E. coli
مبادئات القراءة المهجنة V1-C1 أعطت نواتج تضخيم مع Str. agalactiae لكن ليس مع كل سلالاتStreptococcus

الحساسية

إختبارات الحساسية طبقت بإستعمال سلسلة من عينات الحليب التي أضيف إليها مستعمرات مختلفة منS. agalactiae المنتجة للوحدات
و قد وجد أن التضخيم الذي يلي مباشرة إضافة زرعة من المستعمرة إلى عينة الحليب المختبرة ، نحصل على نواتج ذات تركيز(104-105 cfu/ml)
بينما التضخيم الذي يلي فترة الإغناء ( التحضين ) يعطي نواتج ذات تركيز (1cfu/ml)
شكل (4) يوضح إختبارات الحساسية بإستعمال مبادئات القراءة V1-V2 ( حيث الشكل A الحساسية بإستعمال التضخيم المباشر دون إغناء إنتقائي _ الشكل B
التضخيم بعد الإغناء )







التحكم

عند إستخدام أزواج المبادئات V1-V2 - C1- C2 في خليط التفاعل فإن الحصول على النواتج المستهدفة غير ممكن و لزيادة التحم يجب تطبيق مبادئات القراءة C1- C2 في تفاعل منفصل

عند إستخدام مبادئات القراءة V1-V2 - BMC1 - BMC2 في نفس التفاعل نحصل على النواتج المستهدفة بنجاح ، و هكذا عندما تستعمل هذه المبادئات في مزيج التفاعل فإن المنتج المضخم بواسطة BMC1 - BMC2يظهر دائما في عينات الحليب ، بينما ظهور منتج إضافي من Str. agalactiae يدل على أن نتيجة التشخيص إيجابية
الغياب الكامل لكلا المنتجات يشير إلى خطأ تقني في إجراء عملية التضخيم .

الشكل (5) يبين نواتج التضخيم بإستعمال أزواج المبادئات V1-V2 - BMC1 - BMC2











المناقشة

هدف هذه الدراسة تطبيق تقنية PCR لتمييز و الكشف عن Streptococcus agalactiae في الحليب بإستعمال مبادئات القراءة( V1-V2) .

كل سلالات Str. agalactiae كان عندها مطابقة في( (V1-V2 ،بنك الجينات لم يكتشف مطابقة هذه المبادئات في الكائتات الحية الأخرى . لكن وجد أن
S. difficile تملك مطابقة في هذه المناطق ( V1-V2) مع S. agalactiae .و كما نعلم أن Str. difficile تنتمي إلى مجموعة B Streptococci ، و هذه البكتريا تصيب ذوات الدم البارد ( الضفادع – الأسماك ) لذا لا يحتمل أن تكون سبب لإصابة الأبقار بإلتهاب الضرع (Vandamme et al., 1997)

كل عزلة من Str. agalactiae أعطت ناتج تضخيم ( حجمه 120bp) مع مبادئات القراءة ( V1-V2) و لا نوع أخر من Streptococcus أعطت هذا الناتج .

طبقت في هذه الدراسة إثنتين من إختبارات الحساسية : الإختبار الأول أضيفت فيهStr. agalactiae مباشرة إلى عينات الحليب ، بينت النتائج أن إستخدام PCR فوري يمكن أن يميز التخافيف الأولية من ( 10000-100000cfu/Ml)
بينما بإستخدام PCR بعد التحضين يمكن أن يميز تخافيف أولية قدرها (1 cfu/Ml)
و يمكن أن نعزو ذلك إلى رداءة DNA الميتوكوندري نتيجة التحضين الطويل و لمعالجة ذلك يمكن إجراء التحضين لبضعة ساعات .

في إختبار الحساسية الثاني : عينة من حليب بقرة مصابة مزجت مع عينة حليب من بقرة غير مصابة ، النتائج بينت بعد التحضين أن PCR يمكن أن يميز على الأقل إصابة من بين 500 إصابة و هذه النتيجة تؤكد الحساسية العالية لهذه التقنية .

هذا و حسب نتائج هذه الدراسة يمكن أن نعزو الأسباب التقنية التي تؤدي إلى فشل تفاعل PCR إلى : 1 – إستخدام DNA ذو تركيب لا يناسب التفاعل ( غير مميز للنوع المستهدف )
2-إستعمال أنزيم تفاعل خامل.
و يمكن تفادي هذه الأخطاء بإستعمال أنزيم نشط ، و إستعمال مبادئات السيطرة

الإستنتاجات

1- على الرغم من أن هذه البحث ركز على تشخيص Streptococcus agalactiae e في الحليب فمن الممكن إستعمال هذه التقنية للكشف و تشخيص الأسباب المرضية الأخرى في الحليب
2-إستخدام أنزيمات نشطة و مبادئات سيطرة لتفادي الأخطاء التقنية المسببة لفشل تفاعل PCR أو إعطاء نتائج إيجابية كاذبة .
3-المبادئات (V1-V2) تستخدم لتشخيص agalactiaeStreptococcus و بالتالي يمكن إستخدام هذه المبادئات لتشخيص agalactiaeStreptococcus
عند الإنسان أيضا .
الدورة الحرارية المستخدمة كالتالي : 94 ْ م لمدة 4 دقائق ، 5 دورات على درجة حرارة 94 ْ م (Tm ) ، 72 ْ م لمدة 45 ثانية في كل خطوة ، 20 دورة على درجة حرارة 94 ْ م ، 72 ْ م لمدة 45 ثانية في كل خطوة ، 72 ْ م لمدة 5 دقائق .
و في نهاية التفاعل الناتج ينقل إلى هلام agarose ( 1.8 –2 % ) و يتم تصويره بعد صبغه بـ EtBr ( 0.005 % )

إختبارات الحساسية
إختبارات الحساسية في تجربة PCR تتم كما يلي :
نقوم بعمل 10 تخافيف من مستعمرة بكتريا Str. agalactiae في محلول ملحي . من كل تركيز نأخذ ثلاث عينات : الأولى من أجل طبق العد ، و العينة الثانية للتشخيص الفوري بـPCR ، و الأخيرة لأجل الإغناء الإنتقائي الذي يعقبه تشخيص بـ PCR .
كلتا سلسلة الأنابيب المستخدمة للتشخيص ( الثانية و الثالثة ) تخضع لـ DNA المضخم بواسطة زوج مبادئات القراءة V1 ,V2.
تحدد الحساسيةبحساب عدد المستعمرات المنتجة للوحدات المرئية في أنبوب الإختبار ( ذو التخفيف الأعلى ) ، و ذلك لتحديد نواتج PCR الممكن الحصول عليها .
إختبار الحساسية الثاني يطبق لمعرفة قدرة هذه التقنية على تحديد حليب الأبقار المصابة ، و المضاف إلى حليب أبقار غير مصابة
العينات المخففة تخضع لإغناء يليه تشخيص بـ PCR .
الحساسية تحدد بعامل التخفيف في أنبوب الإختبار ( ذو التركيز الأعلى ) و الذي يمكنه تمييز مقدار نواتج PCR الممكن الحصول عليها .

الله يعطيك العافية ياهندسة على المعلومات القيمة

شكرا لك على هذا الموضوع
و أرجو منك إن أمكن أن تزودنا بالمزيد من المعلومات
أرجو ان يوفقك الله و أن يسدد خطاك ويرسم لك طريق النجاح والتفوق
و لك الشكر الجزيل..............

أشكرك أخي على إثارة هذا الموضوع والشرح الجميل له
بارك الله بك, وجزاك الله عنا كل خير, وجعل عملك في ميزان حسناتك إن شاء الله, إنه ولي ذلك والقادر عليه.
نسأل الله التوفيق لك أخي في دراستك, وتمامها لك على خير ما يرضاه الله لك ولأمته.
كما نتمنى منك أخي بعض التوسع بما يفيد الإخوة الزائرين والأعضاء في المنتدى, كونك تتعامل مع الموضوع, خاصة في حال توافر بعض الصور لنتائج العمل, أو حتى خلال العمل.
وطرق الحصول على تلك المواد وجدواها في حال توافرها, وشكرا لك مرة ثانية

السلام عليكم ورحمة الله وبركاته

أخي الكريم جزاك الله خيرا على هذا الجهد
ولكن لي بعض التساؤلات :
هل حصلت على الدن ا من عينة الحليب من خلال البروتوكول الذي ذكرته ,اعتقد أن هناك معلومات ناقصة ولا يمكن الحصول على الد ن ا من خلال ما ذكرت فقط

هل أجريت البحث في سوريا ؟

وبعد ان وضعنا نتائج البي سي آر في الرحلان الكهربائي (الاليكتروفورسيس) وصبغناها ببروميد الميثايل كيف تمت المقارنة ؟

ولماذا استخدمنا ثلاثة بادئات (بريمر) ,اذ أنني قرأت السبب ولكنني لم لأفهم منه شيئا .

وحتى اختبار حساسية البي سي آر أو اختبار جدوى استخدام البي سي آر للكشف عن البكتيريا أيضا غامضة ,فهل يمكن أن توضحه أكثر .

أعذرني لم أستطع فتح الملف المرفق. فقد يكون فيه توضيحات اضافية

ومرة اخرى جزاك الله كل الخير

المشاركة الأصلية كتبت بواسطة ابوكنان

الله يعطيك العافية ياهندسة على المعلومات القيمة

شكرا على مرورك الكريم...

المشاركة الأصلية كتبت بواسطة night lion

شكرا لك على هذا الموضوع
و أرجو منك إن أمكن أن تزودنا بالمزيد من المعلومات
أرجو ان يوفقك الله و أن يسدد خطاك ويرسم لك طريق النجاح والتفوق
و لك الشكر الجزيل..............

بارك الله فيك و ان شاء الله سأزود المنتدى بالمعلومات أول بأول

المشاركة الأصلية كتبت بواسطة خالد خليل

أشكرك أخي على إثارة هذا الموضوع والشرح الجميل له
بارك الله بك, وجزاك الله عنا كل خير, وجعل عملك في ميزان حسناتك إن شاء الله, إنه ولي ذلك والقادر عليه.
نسأل الله التوفيق لك أخي في دراستك, وتمامها لك على خير ما يرضاه الله لك ولأمته.
كما نتمنى منك أخي بعض التوسع بما يفيد الإخوة الزائرين والأعضاء في المنتدى, كونك تتعامل مع الموضوع, خاصة في حال توافر بعض الصور لنتائج العمل, أو حتى خلال العمل.
وطرق الحصول على تلك المواد وجدواها في حال توافرها, وشكرا لك مرة ثانية

شكرا أخي على المرور الكريم كما قلت سأزود المنتدى بالمعلومات متى تجهز إن شاء الله

المشاركة الأصلية كتبت بواسطة lcd

السلام عليكم ورحمة الله وبركاته

أخي الكريم جزاك الله خيرا على هذا الجهد
ولكن لي بعض التساؤلات :
هل حصلت على الدن ا من عينة الحليب من خلال البروتوكول الذي ذكرته ,اعتقد أن هناك معلومات ناقصة ولا يمكن الحصول على الد ن ا من خلال ما ذكرت فقط

هل أجريت البحث في سوريا ؟

وبعد ان وضعنا نتائج البي سي آر في الرحلان الكهربائي (الاليكتروفورسيس) وصبغناها ببروميد الميثايل كيف تمت المقارنة ؟

ولماذا استخدمنا ثلاثة بادئات (بريمر) ,اذ أنني قرأت السبب ولكنني لم لأفهم منه شيئا .

وحتى اختبار حساسية البي سي آر أو اختبار جدوى استخدام البي سي آر للكشف عن البكتيريا أيضا غامضة ,فهل يمكن أن توضحه أكثر .

أعذرني لم أستطع فتح الملف المرفق. فقد يكون فيه توضيحات اضافية

ومرة اخرى جزاك الله كل الخير

شكرا لك أخي على المرور الكريم و على الأسئلة التي تضيف إغناء للموضوع ...
أما بالنسبة للتساؤلات :
1- الطريقة التي تم استخلاص DNA الحليب منها طريقة معتمدة و مصدرها

Jensen, M. A., J.A.Webster, and N. Straus. 1993. Rapid identification
of bacteria on the basis of polymerase chain reaction–amplified
ribosomal DNA spacer polymorphism. Appl. Environ. Microbiol.

59:945–952.
2-بالنسبة للمقارنة تتم بعد الصبغ بروميد الميثايل و التفريد بالرحلان يتم مقارنة حجم منتج التضخيم ( الوحدة المستخدمة pb ) كل منتج ناتج عن عملية التضخيم يقارن حجمه بمنتجات تضخيم قياسية ( ستندرات ) مأخوذة من بنك الجينات أي إذا كان حجم منتج التضخيم القياسي للسلالة المدروسة 120pb يكون منتج التضخيم الناتج من العينة له نفس الحجم عندها نقول أم العينة النتيجة ايجابية و العينة تحتوي على السلالة المدروسة .
3-بالنسبة لاختيار ثلاث أزواج من البادئات فالزوج الأول ( v1-v2 ) هو الذي يعطي ناتج تضخيم مع Streptococcus agalactia أما الثاني (c1-c2 ) يعطي نواتج نضخيم مع بقية أنواع Streptococcus اما الزوج الاخير ( bmc1-bmc2) يعطي نواتج تضخيم مع dna البقري و هدف هذه العملية حصر نواتج التضخيم مع streptococcus agalactia و إستبعاد غيرها.
4- إختبار الحساسية يستخدم لمقارنة الكشف الفوري بواسطة pcr دون إجراء عملية تحضين و بين إنماء البكتريا ( بتحضينها بوسط مغذي ) ثم الكشف عليها بواسطة هذه التقنية
وتمنيت لو كان بمقدورك فتح الملف المرفق لان الشكل المرفق يوضح هذا الاختبار .

أرجو من الله أن أكون قد وفقت في الإجابة و شكرا أخي على اهتمامك

المشاركة الأصلية كتبت بواسطة م . جهاد التل

شكرا لك أخي على المرور الكريم و على الأسئلة التي تضيف إغناء للموضوع ...
أما بالنسبة للتساؤلات :
1- الطريقة التي تم استخلاص DNA الحليب منها طريقة معتمدة و مصدرها

Jensen, M. A., J.A.Webster, and N. Straus. 1993. Rapid identification
of bacteria on the basis of polymerase chain reaction–amplified
ribosomal DNA spacer polymorphism. Appl. Environ. Microbiol.

59:945–952.
2-بالنسبة للمقارنة تتم بعد الصبغ بروميد الميثايل و التفريد بالرحلان يتم مقارنة حجم منتج التضخيم ( الوحدة المستخدمة pb ) كل منتج ناتج عن عملية التضخيم يقارن حجمه بمنتجات تضخيم قياسية ( ستندرات ) مأخوذة من بنك الجينات أي إذا كان حجم منتج التضخيم القياسي للسلالة المدروسة 120pb يكون منتج التضخيم الناتج من العينة له نفس الحجم عندها نقول أم العينة النتيجة ايجابية و العينة تحتوي على السلالة المدروسة .
3-بالنسبة لاختيار ثلاث أزواج من البادئات فالزوج الأول ( v1-v2 ) هو الذي يعطي ناتج تضخيم مع Streptococcus agalactia أما الثاني (c1-c2 ) يعطي نواتج نضخيم مع بقية أنواع Streptococcus اما الزوج الاخير ( bmc1-bmc2) يعطي نواتج تضخيم مع dna البقري و هدف هذه العملية حصر نواتج التضخيم مع streptococcus agalactia و إستبعاد غيرها.
4- إختبار الحساسية يستخدم لمقارنة الكشف الفوري بواسطة pcr دون إجراء عملية تحضين و بين إنماء البكتريا ( بتحضينها بوسط مغذي ) ثم الكشف عليها بواسطة هذه التقنية
وتمنيت لو كان بمقدورك فتح الملف المرفق لان الشكل المرفق يوضح هذا الاختبار .

أرجو من الله أن أكون قد وفقت في الإجابة و شكرا أخي على اهتمامك

أخي الكريم لقد اطلعت على المصدر الذي ذكرته فلم أجد شيئا له علاقة بعزل الد ن ا من الحليب والطريقة مغايرة للطريقة التي ذكرتها أنت.

أولا اخي الكريم كما ذكرت فانك وضعت النتائج والمناقشة وهذا يدل انك انتهيت من البحث .

ثانيا : للاستخلاص فانك ذكرت EDTA بفر وهنا لا يستخدم لوحده انما يستخدم مع Tris بفر ويسميان مع بعض TE بفر .مهمته الحفاظ على حيوية الد ن ا , وتثبيط عمل انزيم dnase الذي يحلل الد ن ا .

وثم وبعد اضافة أنزيم بروتياز k والتحضين تأتي مرحلة الغلي , لم تذكرها . اضافة الى مراحل اخرى وخطوات ايضا لم تذكر وهي ان بدت بسيطة ولكنها في استخلاص الد ن ا تكون ضرورية واغفال اي خطوة مهما بدت بسيطة تمنعك من الوصول لل د ن ا او تثبط عملية تضخيم الد ن ا بالبي سي آر .


ثالثا : استخدام البريمر (البادئات) فهناك خياران اما انك اخذتها من بحث سابق اثبتوا انها بريمر انتقائي لهذا النوع البكتيري وهنا عليك ذكر المرجع , أو أنك أنت من صممت هذه البرايمرات لتكون انتقائية وخاصة بهذا النوع وهنا يجب ان تذكر كيف تم التصميم وبأي برنامج ومبدأ العمل , وكيف أثبت أنها انتقائية.

وهناك نقاط استفهام اخرى بعد ان توضح لنا ما سبق .

ولك جزيل الشكر والنقاش فيه الفائدة للجميع ان شاء الله

المشاركة الأصلية كتبت بواسطة lcd

أخي الكريم لقد اطلعت على المصدر الذي ذكرته فلم أجد شيئا له علاقة بعزل الد ن ا من الحليب والطريقة مغايرة للطريقة التي ذكرتها أنت.

أولا اخي الكريم كما ذكرت فانك وضعت النتائج والمناقشة وهذا يدل انك انتهيت من البحث .

ثانيا : للاستخلاص فانك ذكرت EDTA بفر وهنا لا يستخدم لوحده انما يستخدم مع Tris بفر ويسميان مع بعض TE بفر .مهمته الحفاظ على حيوية الد ن ا , وتثبيط عمل انزيم dnase الذي يحلل الد ن ا .

وثم وبعد اضافة أنزيم بروتياز k والتحضين تأتي مرحلة الغلي , لم تذكرها . اضافة الى مراحل اخرى وخطوات ايضا لم تذكر وهي ان بدت بسيطة ولكنها في استخلاص الد ن ا تكون ضرورية واغفال اي خطوة مهما بدت بسيطة تمنعك من الوصول لل د ن ا او تثبط عملية تضخيم الد ن ا بالبي سي آر .


ثالثا : استخدام البريمر (البادئات) فهناك خياران اما انك اخذتها من بحث سابق اثبتوا انها بريمر انتقائي لهذا النوع البكتيري وهنا عليك ذكر المرجع , أو أنك أنت من صممت هذه البرايمرات لتكون انتقائية وخاصة بهذا النوع وهنا يجب ان تذكر كيف تم التصميم وبأي برنامج ومبدأ العمل , وكيف أثبت أنها انتقائية.

وهناك نقاط استفهام اخرى بعد ان توضح لنا ما سبق .

ولك جزيل الشكر والنقاش فيه الفائدة للجميع ان شاء الله

أشكرك أخي على النقاش المفيد و أود أن أنوه :
1- البحث قدتم و نشر في كلية الهندسة الغذائية و التقانة الحيوية - جامعة واشنطن لكنه يجرى في سورية كبحث علمي و ليس كرسالة ماجستير او دكتوراه و لم ينته بعد
2- فيما يخص إستخدام TE نعم أعتذر عن الخطأ الغير مقصود حيث يستخدم TE كبفر أيضا هناك مرحلة الغلي بعد مرحلة التحضين لمدة 15 دقيقة
3- فيما يخص استخدام البريمرات تم إستخدامها كبريمرات إنتقائية من دراسة سابقة :

Wang, Q., F. B. Vasey, J. P. Mahfood, J. Valeriano, K. S. Kanik,
B. E. Anderson, and P. H. Bridgeford. 1999. V2 regions of 16S
ribosomal RNA used as amolecular marker for the specific identification
of streptococci in peripheral blood and synovial fluid from

patients with psoriatic arthritis. Arthritis Rheum. 42:2055–2059
أرجو أن أكون وضحت و شكرا أخي الكريم على النقاش و حبذا لو أشرت إلى نقاط الأستفهام الاخرى لتعم الفائدة

السلام عليكم ورحمة الله وبركاته

النقطة الاكثر غموضا قد توضحت وهي أن ما ذكرته سابقا هي ترجمة لبحث قد أنجز في جامعة واشنطن ونشر وتريد تطبيقه في سوريا .
فيا حبذا يا أخي لو ذكرت اسم البحث ومن قام به وأرفقته مع الترجمة التي وضعتها لتعم الفائدة وحتى لا يساء الفهم .

جزاك الله خيرا على الترجمة ووضعها في المنتدى ليستفيد منها الاخرون
وتمنياتي لك بالتوفيق في عملك

السلام عليكم و رحمة الله و بركاته
بالنسبة للبحث فهو كما قلت سابقا مازال في طور التقييم و معروض على لجنة علمية لمعرفة مدى قبوله أما النتائج المعروضة فهي أحد الابحاث التي إعتمدت عليها الدراسةالمرجعية وحالما يتم تسجيل البحث فان شاء الله ساذكر كل الابحاث المتعلقة بالدراسة المرجعية أرجو أن أكون قد أوضحت الالتباس و شكرا.

شكراً لك على المعلومات لكن لو سمحت أخي إذا عندك النسخة الأصلية للبحث باللغة الإنكليزية أرجو إرسالها