أحمد مصطفى كامل عبد العزي
05-02-2013, 12:25 AM
مكونات الأوساط الغذائية والمواد اللازمة لإجراء التجارب
أولاً: مكونات الأوساط الغذائية:
الوسط الغذائي الآجار المغذي : Nutrient agar
1- ببتون Peptone 6 جم/ل
2- مستخلص خميرة Yeast extract 1 جم/ل
3- مستخلص لحم Beef extract 2 جم/ل
4- كلوريد الصوديوم NaCl 5 جم /ل
5- آجار Agar 17 جم/ل
تذاب هذه المواد في لتر ماء مقطر. D.water 1 لتر
بيئة المرق المغذيNutrient broth :
1- ببتون 5 جم/ل
2- مستخلص لحم 3 جم/ل
3- قد يضاف كلوريد الصوديوم 0.5 جم/ل
تذاب هذه الكميات في لتر من الماء المقطر.
بيئة شابكس دوكس آجارChabex dox agar :
1- ملح كلوريد البوتاسيوم KCl 0.5 جم/ل
2- ملح نترات الصوديوم Na2NO3 2 جم/ل
3- كبريتات المغنيسيوم MgSO4 0.5 جم/ل
4- فوسفات ثنائي هيدروجين البوتاس KH2PO4 1 جم/ل
5- سكروز 10 جم/ل
6- آجــار 17 جم/ل
7- روز بنغال(يستعمل كمضاد لمنع نمو البكتيريا) 10 مل/ل
تضاف هذه الكميات إلى لتر من الماء المقطر.
قد يضاف كبريتات الحديدوز بنسبة 0.01 جم/ ل
بيئة مرق تخمر اللاكتوز Lactose fermentation broth :
1- مستخلص لحم 3 جرام
2- ببتون 5 جرام
3- لاكتوز 5 جرام
4- بروموثيمول الأزرق 0.016
5- ماء مقطر 1 لتر
تعقم البيئة الغذائية تعقيم متقطع
بيئة الجيلاتين المغذي Nutrient gelatin :
مستخلص لحم 3 جرام
ببتون 5 جرام
جيلاتين 150 جرام
ماء مقطر 1 لتر
تعقم البيئة تعقيما متقطعا .
مرق التربتونTrypton broth :
تربتون 10 جرام
مستخلص لحم 3 جرام
ماء مقطر 1 لتر
بيئة الكريستال البنفسجي Crystal violet agar :
تحضر بيئة الآجار المغذي كما سبق ثم يضاف ملل من صبغة الكريستال البنفسجي للوسط الغذائي ثم تعقم البيئة وتحضر صبغة الكريستال البنفسجي كما يلي :
بلورات كريستال بنفسجي 1 جرام
ماء مقطر 100 مل
بيئـة الطحالب:
نترات الكالسيوم Ca(NO3)2 2 جم
كلوريد البوتاسيوم KCl 0.5 جم
كبريتات المغنيسيوم المائي MgSO4 0.5 جم
فوسفات أحادي البوتاسيوم KH2PO4 0.5 جم
ماء الصنبور 1000 ملل
** نخفف جزء واحد من هذا المحلول مع خمسة أجزاء من ماء الصنبور.
كلوريد الحديد المائي FeCl3.6H2O 0.01 جم
بيئة آجار أندو Endo agar :
ببتون 10 جرام
لاكتوز 10 جرام
بوتاسيوم فوسفات الهيدروجين K2HPO4 3.5 جرام
كبريتيد الصوديوم 2.5 جرام
فوكسين قاعدي 0.5 جرام
آجار 15 جرام
ماء مقطر 1 لتر
بيئة آجار ايوسين أزرق اميثيلين ( EMB ) Eosin Methylene bhue agar :
ببتون Peptone 10 جرام
لاكتوز Lactose 5 جرام
سكروز Sucrose 5 جرام
فوسفات ثنائي البوتاسيوم Dipotassium phosphate 2 جرام
ايوسينY Eosin Y 0.4 جرام
أزرق الميثيلين Methylene blue 0.65 جم
آجار Agar 13.5 جرام
ماء مقطر D.water 1 لتر
يمكن زيادة تركيز الآجار في البيئة إلى 5 % ( أي إضافة 17 جم من الآجار بدل الكمية السابقة ) لمنع انتشار Proteus .
بيئة آجار النشا Starch agar :
تربتون 10 جرام
مستخلص خميرة 10 جرام
بوتاسيوم فوسفات الهيدروجين 5 جرام
نشا ذائب 3 جرام
آجار 15 جرام
ماء مقطر 1 لتر
يضاف النشا إلى كمية ماء قليلة ويتم التسخين مع التقليب المستمر حتى يذوب النشا , يستمر التسخين حتى الغليان وبسرعة يتم إضافة النشا الذائب إلى بقية المكونات .
اختبار الاندول , أحمر الميثايل , فوكس بروسكاور , الستراتIMVIC :
اختبار الاندول
تربتون 10 جرام
مستخلص خميرة 5 جرام
بوتاسيوم فوسفات الهيدروجين 5 جرام
جلوكوز 1 جرام
بعد الزراعة والتحضين يتم استخدام طريقة كوفاكس Kovac`s
باضافة 0.3 مل من محلول كوفاكس إلى 6 مل من المزرعة السائلة ثم اخلطهما جيدا فنلاحظ انفصال طبقة كحولية فوق المخلوط ويتحول لون هذه الطبقة إلى اللون الأحمر بعد عدة دقائق في حال وجود الإندول .
ويتركب محلول كوفاكس من :
بارا داي ميثايل امينوبنزالدهيد 5 جرام
كحول أمايل أو بيوتايل 75 مل
حمض هيدروكلوريك مركز 25 مل
تذاب المادة الأولى في الكحول ثم يضاف الحمض بحذر بعد ذلك .
اختبار أحمر الميثايل وفوكس بروسكاور Methyl red voges proskauer medium :
جلوكوز 5 جرام
بروتيوز ببتون 5 جرام
بوتاسيوم فوسفات الهيدروجين 5 جرام
ماء مقطر 1 لتر
Ph = 6.9
يمكن استخدام الببتون باضافة 7 جرام إلى البيئة بدلا من بروتيوز البتون وإضافة الدكستروز 5 جم بدلاً من الجلوكوز . ويستخدم هذا الوسط للإختبارات الكيميائية المفرقة للبكتيريا المعوية.
بيئة آجار الجلوكوز Glucose agar :
1- مستخلص لحم 3 جم
2- ببتون 5 جم
3- جلوكوز 10 جم
4- آجار 17 جم
5- ماء مقطر 1 لتر
بيئة آجار دكستروز البطاطس ( PDA ):
1- مستخلص مائي لـ 200 جم من البطاطس ( يحضر بطهي البطاطس ثم هرسه وتحويله إلى سائل كثيف .
2- دكستروز 20 جم
3- آجار 20 جم
4- ماء مقطر 1 لتر
بيئة آجار أحمر الكونغو :
مانيتول 10 جم
فوسفات ثنائي البوتاسيوم 0.5 جم
كبريتات مغنيسيوم 0.2 جم
كربونات كالسيوم 3 جم
كلوريد صوديوم 0.1 جم
مستخلص خميرة 1 جم
أحمر الكونغو ( 1جم تذاب في 400 مل ) 10 مل
آجار 20 جم
تذاب الكميات في 1 لتر
بيئة أومليانسكي :
كبريتات أمونيوم 1 جم
فوسفات ثنائي البوتاسيوم 1 جم
كبريتات مغنيسيوم 0.5 جم
كربونات كالسيوم 2 جم
كلوريد صوديوم 0.1 جم
ماء مقطر 1 لتر
بيئة قاعدة المرق القرمزي :
1- ببتون 10 جم
2- مستخلص لحم 1 جم
3- كلوريد صوديوم 5 جم
4- برومو كريزول الأرجواني 0.016 جم
5- ماء مقطر 1 لتر
بيئة دايبوز :
1- نترات صوديوم 0.5 جم
2- فوسفات ثنائي البوتاسيوم 1 جم
3- كبريتات مغنيسيوم 0.5 جم
4- كلوريد البوتاسيوم 0.5 جم
5- كبريتات حديديك 0.001 جم
6- ماء مقطر 1 لتر
بيئة كليجلر Kligler agar media :
1- مستخلص لحم 3 جم
2- مستخلص خميرة 3 جم
3- ببتون 15 جم
4- بروتيوز ببتون 5 جم
5- لاكتوز 10 جم
6- جلوكوز 1 جم
7- كبريتات حديدوز 0.2 جم
8- كلوريد صوديوم 5 جم
9- ثيوكبريتات الصوديوم 0.3 جم
10- آجار 15 جم
11- أحمر فينول 0.024 جم
12- ماء مقطر 1 لتر
Salmonella Shigella agar ( S.S.A )
1- مستخلص لحم 5 جم
3- ببتون 5 جم
4- أملاح الصفراء Bile salt mixture 8.5 جم
5- لاكتوز 10 جم
6- سترات الصوديوم 8.5 جم
7- سترات الحديدوز 1 جم
8- أخضر لامع BRILLIANT GREEN 0.33 جم
9- ثيوكبريتات الصوديوم Sodium thiosulfate 8.5 جم
10- آجار 15 جم
11- أحمر فينول Nutral red 0.024 جم
12- ماء مقطر 1 لتر
أذب بالغليان ( لاتستعمل الأوتوكليف ) وتستعمل هذه البيئة لعزل العصيات المعوية الضارة وتمنع نمو بكتيريا Coli form كما تميز بين الأنواع المخمرة للاكتوز وغير المخمرة .
Tetrathionate broth
Proteose peptone 5 gm
Bile salt 1 gm
Calcium carbonate 10 gm
Sodium thiosulphate 30 gm
D.water 1000 ml
وزع 10 مل في كل أنبوب ثم سخن حتى الغليان وقبل الإستعمال يضاف 0.2 مل من محلول اليود إلى كل أنبوب و المحضر كما يلي ( 6 جم يود + 5 جم يوديد البوتاسيوم + 20 مل ماء مقطر ) .
وتستخدم هذه البيئة لعزل السالمونيلا ماعدا Salmonella typhi .
بيئة لبن البروموكريزول الأرجواني :
1- لبن فرز طازج 100 مل
2- بروموكريزول الأرجواني 0.016 جم
تعقم البيئة تعقيماً متقطعاً
مرق دكستروز تريبتون بروموكريزول الأرجواني :
1- تريبتون 10 جم
2- دكستروز 5 جم
3- بروموكريزول الأرجواني 0.04 جم
4- ماء مقطر 1 لتر
بيئة لبن تباع الشمس :
يحضر بإضافة كمية كافية من محلول مائي مشبع من تباع الشمس إلى لبن فرز طازج حتى يصبح اللون أزرق واضح ثم تعقم البيئة تعقيماً متقطعاً .
بيئة مرق النترات Nitrate broth :
1- مستخلص لحم 3 جم
2- ببتون 5 جم
3- نترات بوتاسيوم 1 جم
4- ماء مقطر 1 لتر
أو يمكن استخدام التركيبة التالية لفحص اختزال النترات
Tryptone 5 gm
Neopeptone 5 gm
D.water 1000 ml
Potassium nitrate reagent 1 gm
Glucose 0.1 gm
قبل إضافة المادتين الأخيرتين ( الجلوكوز ونترات البوتاسيوم ) تغلى المواد السابقة واجعل ال ph = 7.3 . ثم توزع 5ملل في أنابيب ثم تعقم لمدة 15 دقيقة .
ويتكون محلول الفحص للنترات من
محلول A : أذب 8 جم من Sulphanilic acid في لتر من 5N acetic acid
محلول B : أذب 5 جم من α-naphthylamine في لتر من 5N acetic acid
Phenylalanin agar
Yeast extract 3 gm
DL-phenylalanin 2 gm
Disodium phosphate 1 gm
NaCl 5 gm
Agar 13 gm
D.water 1000 ml
وزع 3 مل في كل أنبوب ثم عقم عند 121 ْم لمدة 10 دقائق ثم اتركها لتصلب لعمل أنابيب مائلة slant تستخدم هذه البيئة للتأكد من قدرة البكتيريا على إزالة مجموعة الأمين من الحامض الأميني فينيل ألانين وتكوين Phenylpyruvate .
Sabouraud dextrose agar ( SDA )
دكستروز 40 جم
ببتون 10 جم
آجار 15 جم
ماء مقطر 1 لتر
PH 5.4
ويمكن استخدام المكونات الجاهزة كما يلي :
Sabouraud dextrose agar 32.5 gm
Agar 2.5 gm
D.water 500 ml
تذاب هذه المواد وتغلى للتجانس ثم توزع في أنابيب ثم تعقم وهي بوضع مائل لعمل Slant . ويمكن إضافة المضادات الحيوية لها بعد التعقيم . وتستعمل هذه البيئة لتنمية الفطريات . كما يمكن استخدام سكر الجلوكوز أو المالتوز.
بيئة آجار سترات الحديديك ( الكشف عن انتاج كبريتيد الهيدروجين )
1- بروتيوز ببتون 2 جم
2- فوسفات ثنائي البوتاسيوم 0.1 جم
3- سترات الحديديك 0.05 جم
4- آجار 15 جم
5- ماء مقطر 1 لتر
Desoxycholate agar
Peptone 10 gm
Lactose 10 gm
Na.citrate 1 gm
Ferric citrate 1 gm
NaCl 5 gm
Dipotassium phosphate 2 gm
Na-desoxycholate 1 gm
Agar 16 gm
Neutral red 0.033 gm
d.water 1000 ml
تستعمل هذه البيئة لعزل العصويات المعوية السالبة لجرام وللتمييز بين البكتيريا المخمرة لسكر اللاكتوز من غير المخمرة .
Desoxycholate citrate agar ( D.C.A )
Meat infusion form 350 gm
Peptone 10 gm
Lactose 10 gm
Na.citrate 20 gm
Ferric citrate 1 gm
Na-desoxycholate 5 gm
Agar 16 gm
Neutral red 0.02 gm
d.water 1000 ml
ph = 7.3
تستعمل هذه البيئة لعزل السالمونيلا والشايجيلا من البراز أو أي عينة أخرى .
كما يمكن تحضيره بالطريقة التالية :
Meat extract 20 gm
Pepton 20 gm
Lactose 40 gm
Nutral red 0.1 gm
Agar 90 gm
d.water 4 L
يضاف لكل 100 ملل من المكونات السابقة 5 مل من محلول ( أ ) المكون من :
17 % سترات الصوديوم و 17 % ثيوسلفات الصوديوم و 2 % سترات الأمونيوم والحديديك. ثم يضاف 5 ملل من المحلول ( ب ) المكون من 10 % ديسوكسيكولات الصوديوم . وتذاب المكونات بالتسخين على اللهب ولا يعقم بالأوتوكليف ولايتم إذابته مرة أخرى إذا حدث له تصلب .
ويستخدم هذا الوسط لعزل السالمونيلا .
بيئة مرق اليوريا Urea broth :
1- فوسفات ثنائي البوتاسيوم 1 جم
2- كلوريد كالسيوم 0.1 جم
3- كبريتات مغنيسيوم 0.3 جم
4- كلوريد صوديوم 0.1 جم
5- كلوريد حديديك 0.01 جم
6- مستخلص لحم 5 جم
7- يوريا 20 جم
8- ماء مقطر 1 لتر
تذاب اليوريا في 50 مل ماء وتعقم بالترشيح ثم تضاف إلى باقي مكونات البيئة بعد تعقيمها .
كما يمكن تحضير بيئة آجار اليوريا urea agar المستخدمة في اختبار إنزيم اليورييز كما يلي :
Peptone 1 gm
Glucose 1 gm
NaCl 5 gm
Mono-K-phosphate 2 gm
Phenol red 0.012 gm
Agar 20 gm
D.water 1000 ml
Ph = 6.9
تحضر البيئة الأساس وتعقم بالأوتوكلاف لمدة 15 دقيقية في قارورة تحتوي على 100 – 200 مل ثم تحفظ لحين الحاجة .
تحضر اليوريا 29 % محلول اليوريا المعقم بالترشيح ويضاف منه 10 مل من اليوريا / 100 مل من البيئة الأساس المذابة والمبردة لدرجة 50 ْم لعدم تكسر اليوريا بالحرارة العالية ثم توزع بيئة اليوريا في أنابيب بمقدار 3 مل لكل أنبوب وتبرد بشكل مائل حتى تتصلب .
تستعمل هذه البيئة لمعرفة البكتيريا المنتجة لإنزيم اليورييز مثل proteus و Cryptococcus كما يمكن لبعض بكتيريا Coli form إنتاج هذا الإنزيم وتمييزها عن Salmonella , Shigella غير المنتجة للإنزيم .
T.C.B.S ( Thiosulphate citrate bile salt )
Peptone from casien 5 gm
Peptone from meat 5 gm
Yeast extract 5 gm
Sodium citrate 10 gm
Sodium tiosulfate 10 gm
Oxgall 5 gm
Sodium choclate 3 gm
Sucrose 20 gm
NaCl 10 gm
Iron III citrate 1 gm
Thymol blue 0.04 gm
Bromothymol blue 0.04 gm
Agar 14 gm
Ph = 8.8
يستعمل هذا الوسط لتنمية بكتيريا الكوليرا Vibreo cholera.
بيئة مرق ببتون أملاح الصفراء واللاكتوز ودليل الأخضر الزاهي :
1- مستخلص أملاح الصفراء لثور 30 جم
2- لاكتوز 5 جم
3- ببتون 20 جم
4- كلوريد الصوديوم 5 جم
5- أخضر زاهي 1% 2 مل
6- ماء مقطر 1 لتر
مرق خلاصة المالت ( الشعير ) Malt extract broth :
1- مستخلص المالت 20 جم
2- ماء مقطر 1 لتر
يستخدم كوسط عام لنمو الفطريات وخاصة الخمائر ويمكن استخدامه كوسط صلب بإضافة 20 جم من الآجار .
بيئة آجار اختبار الحركة Motility test agar
1- تربتوز 10 جم
2- كلوريد صوديوم 5 جم
3- آجار 5 جم
4- ماء مقطر 1 لتر
بيئة آجار الثيوجليكولات Thioglycolate medium
1- ثيوجليكولات الصوديوم 0.5 جم
2- آجار 20 جم
3- ماء مقطر 1 لتر
كما يمكن استخدام التركيبة التالية :
ببتون 20 جم
ل- سيستين L-cystine 0.25 جم
جلوكوز Glocose 6 جم
كلوريد الصوديوم 2.5 جم
كبريتات الصوديوم Na-sulfate 0.5 جم
كبريتيد الصوديوم Na-sulfite 0.1 جم
آجار 0.7 جم
ماء مقطر 1 لتر
Ph = 7.2
Triple sugar iron agar ( T.S.I )
Peptone 20 gm
NaCl 5 gm
Lactose 10 gm
Sucrose 10 gm
Glucose 1 gm
Ferrous ammonium sulphate 0.2 gm
Na-thiosulphate 0.2 gm
Phenol red 0.025 gm
Agar 13 gm
D.water 1000 ml
Ph = 7.3
تستخدم هذه البيئة لمعرفة تخمر السكريات وإنتاج غاز كبريتيد الهيدروجين H2S للتحقق من وجود العصويات السالبة لصبغة جرام .
بيئة آجار خلاصة الخميرة
1- فوسفات ثنائي البوتاسيوم 2 جم
2- خلاصة اللحم 3 جم
3- خلاصة الخميرة 2 جم
4- تربتون 5 جم
5- جلوكوز 10 جم
6- آجار 15 جم
7- ماء مقطر 1 لتر
بيئة آجار الدم Blood agar
1- مستخلص لحم Beef extract 3 جم
2- تربتوز Treptose 10 جم
3- كلوريد صوديوم NaCl 5 جم
4- آجار Agar 15 جم
5- ماء مقطر D.water 1 لتر
قبل صب البيئة في الأطباق يضاف 5 % دم معقم .
أو يمكن استخدام blood agar base medium ( trypticase soy agar ) 500 ملل يضاف لها دم معقم بالترشيح 20 ملل ( دم أغنام أو خيول )
تعقم بيئة أساس الدم كالمعتاد وتترك لتبرد عند 48 ْم ثم يضاف لها الدم المعقم ويخلط جيداًثم تصب في أطباق وتبرد ويفضل استخدامها قبل أسبوع مع الحفظ الجيد في الثلاجة .
وتعتبر هذه البيئة غنية تشجع نمو البكتيريا ذات الإحتياجات الخاصة . كما يستخدم للتفريق بين البكتيريا المحللة للدم وغير المحللة .
Chocolate agar
تحضر بنفس كميات بيئة آجار الدم مع ملاحظة ما يلي :
بعد تعقيم بيئة blood agar يضاف لها الدم ثم يسخن على اللهب حتى الغليان فيتحول لونها للون البني ( تسخن الكمية على اللهب حتى الغليان ولمدة دقيقة واحدة لتتكسر مكونات خلايا الدم الحمراء وينطلق الهيموجلوبين فيتحول اللون للبني ) .
ثم تصب الأطباق وتبرد وتحفظ في الثلاجة .
Thayer-martin agar
تستعمل هذه البيئة لتنمية بكتيريا Neisseria meningitidis , Neisseria gonorrhoeae وتحضر كما تحضر chocolate agar إلا أنه يضاف لها مضادات حيوية تساعد في قتل الميكروبات الملوثة للعينة الطبية المشتبه وجود بكتيريا Neisseria فيها .
بيئة مرق اختزال الكبريتات
1- كبريتات الأمونيوم 2 جم
2- كبريتات الحديدوز 0.01 جم
3- فوسفات ثنائي البوتاسيوم 0.5 جم
4- لكتات الصوديوم 5 جم
5- ماء مقطر 1 لتر
بيئة مرق النترات
1- ببتون خالي من النترات 1 جم
2- كلوريد الصوديوم 0.5 جم
3- نترات البوتاسيوم 0.5 جم
4- ماء مقطر 1 لتر
بيئة سليولوز الببتون
1- فوسفات ثنائي الأمونيوم 2 جم
2- فوسفات أحادي البوتاسيوم 1 جم
3- كبريتات المغنيسيوم 0.3 جم
4- كلوريد الكالسيوم 0.4 جم
5- كلوريد الحديديك 0.01 جم
6- كربونات الكالسيوم 3 جم
7- ببتون 5 جم
يضاف للبيئة قصاصات ورق ترشيح .
بيئة بورديت جينجس Boredt -gengous medium
مستخلص البطاطس Poteto infusion form 125 جم
NaCl 5.5 جم
آجار 20 جم
ماء مقطر 1 لتر
تعقم هذه البيئة كالمعتاد ثم تبرد عند 50 ْم ثم يضاف لها 15 – 20 % دم معقم وتستعمل هذه البيئة لتنمية بكتيريا Borditella pertussis .
Brain heart infusion broth
Calf brain infusion 200 gm
Beef heart infusion 250 gm
Proteose peptone 10 gm
Dextrose 2 gm
NaCl 5 gm
Na2PO4 2.5 gm
D.water 100 ml
Ph = 7.4
تستعمل هذه البيئة لتنمية Pneumococcus لإجراء اختبار الذوبان في أملاح الصفراء
Bile solubility test .
مرق السيلينايت Selenite broth
Anhydrous sodium hydrogen selenite 4 gm
Disodium hydrogen phosphate 9.5 gm
Sodium hydrogen phosphate 0.5 gm
Pepton 5 gm
Lactose 4 gm
d.water 1 L
يعقم في حمام مائي ولا يستخدم الأوتوكليف ويستخدم هذا الوسط لعزل السالمونيلا من العينات الملوثة من البراو والبول للقضاء على البكتيريا الملوثة للعينة .
Brilliant green agar
Yeast extract 3 gm
Proteose peptone NO.3 10 gm
NaCl 5 gm
Lactose 10 gm
Sacchrose 10 gm
Phenol red 0.08 gm
Brilliant green 0.125 gm
Agar 20 gm
D.water 1000 ml
p.h = 6.9
تستعمل هذه البيئة لتنمية بكتيريا Salmonella ماعدا Salmonella typhi ولا تنمو بكتيريا Shigella على هذه البيئة .
بيئة سيمون Simmon citrate agar
كبريتات المغنيسيوم Magnesium sulfate 0.2 جم
فوسفات الأمونيوم ثنائي الهيدروجين Ammonium phosphate hidrogen 0.2 جم
فوسفات الأمونيوم والصوديوم Ammonium sodium phosphate 0.8 جم
سترات الصوديوم الثلاثية Sodium citrate 2 جم
كلوريد الصوديوم Sodium chloride 5 جم
صبغة أزرق بروموثيمول Bromothymol blue 0.08 جم
آجار Agar 15 جم
ماء مقطر D.water 1 لتر
PH 6.9
يستخدم هذا الوسط للتمييز بين البكتيريا المعوية من حيث استخدام السترات كمصدر للكربون فيحدث تغير للصبغة المضافة في البيئة .
كما يمكن تحضيرها كما يلي :
اختبار السترات Citrate agar :
فوسفات أمونيوم NH4-hydrogen phosphate 1 جرام
فوسفات أحادي البوتاسيوم 1 جرام
كبريتات مغنيسيوم Magnesium sulfate 0.2 جرام
سترات صوديوم Sodium citrate 2 جرام
Bromothymol blue 0.08 جم
NaCl 5 جم
ماء مقطر 1 لتر
آجار Agar 20 جم
Ph = 6.9
يمكن استخدام هذه البيئة سائلة بدون إضافة الآجار وتستخدم للتحقق من استخدام البكتيريا للسترات كمصدر للكربون .
Loffler coagulated serum medium
أضف ثلاث وحدات من مصل الحصان إلى وحدة واحدة من 1% جلوكوز ثم ضع الخليط في أنبوب وسخن لمدة ساعتين عند 75 – 85 ْم ( كرر عملية التسخين 3 أيام متتالية ) ثم عقم بالأوتوكليف لمدة 15 دقيقة حتى تتجلط البيئة .
أخرج الهواء بالتدريج حتى تحافظ على الضغط داخل الجهاز ثم عقم بالأوتوكليف مرة أخرى عند 121 ْم لمدة 15 – 20 دقيقة .
Lowenstein-jensen medium ( L.J )
Salt solution
Monopotassium phosphate 2.4 gm
Magnesium sulfate 7H2O 0.24 gm
Magnesium citrate 0.6 gm
Asparagin 3.6 gm
Glycerol reagent grade 1 12 ml
D.water 600 ml
Poteto flour 30 gm
Homogenized whole egg 1000 ml
Malachite green 2% aqueous 20 ml
أضف مسحوق البطاطس إلى قارورة المحلول الملحي وعقم بالأوتوكليف لمدة 30 دقيقة ثم اغسل بيض طازج بعمر أقل من أسبوع بـ 5 % محلول صابون وضع البيض فيه لمدة 30 دقيقة ثم ضعها في الماء الجاري حتى تصبح صافية ثم اغمرها في 70 % كحول لمدة 15 دقيقة ثم اكسرها وضعها في قارورة معقمة واخلطها جيداً حتى تتجانس مكوناتها ثم صفي المحلول بشاش معقم أربع طبقات . ثم أضف لتراً من خليط البيض المتجانس إلى القارورة المحتوية على المحلول الملحي ومحلول البطاطس ثم أضف كمية محلول أخضر المالاكيت للقارورة واخلطه جيداً .
وزع البيئة في أنابيب اختبار معقمة في كل أنبوب 6 مل ثم كثف الأنابيب على درجة 85 ْم لمدة 50 دقيقة يفضل فحص الأنابيب بوضع أحدها في الحضان لمدة 48 ساعة خشية حدوث تلوث بها ويمكن حفظها في الثلاجة لفترة شهر .
وتستعمل هذه البيئة لتنمية Mycobacterium tuberculosis .
Macconkey agar
Peptone 17 gm
Proteose peptone 3 gm
Lactose 10 gm
Bile salt 1.5 gm
NaCl 5 gm
Agar 15 gm
Neutral red 0.03 gm
Crystal violet 0.001 gm
D.water 1000 ml
يعتبر وسط مفرق بين البكتيريا المخمرة لسكر اللاكتوز وغير المخمرة بحيث تظهر البكتيريا المخمرة للاكتوز مستعمرات وردية بينما غير المخمرة تظهر مستعمرات شفافة وهذه البيئة تظهر البكتيريا المعوية coli form . يمكن زيادة 3.5 جم للبيئة لمنع انتشار بكتيريا Proteus .
Sensitivity test agar ( Muller – Hinton )
Pancreatic digest of casien 2 gm
Peptic of animal tissue 7 gm
Veal infusion 9 gm
Dextrose 10 gm
NaCl 3 gm
Disodium phosphate 2 gm
Sodium acitate 1 gm
Adinine sulfate 0.01 gm
Guanine 0.01 gm
Uracil 0.01 gm
Xanthine 0.01 gm
Agar 14 gm
Ph = 7.3
تستعمل هذه البيئة لفحص حساسية البكتيريا للمضادات الحيوية .
CLED Medium ( Mackey & Sandys )
The cystine – lactose – electrolytes – deficient medium
Peptone 4 gm
Beef extract 3 gm
Tryptone 4 gm
Lactose 10 gm
L-cystine 0.128 gm
Bromothymol blue 0.2 gm
D.water 1000 ml
Ph = 7.3
تعطي هذه البيئة الصفات التالية لكل نوع من البكتيريا :
E.coli : مستعمرات صفراء معتمة وتظهر سلالات الـ E.coli غير المخمرة للاكتوز زرقاء اللون .
Klebsiella : مستعمرات مخاطية بلون أصفر- أبيض مزرق .
Proteus : مستعمرات زرقاء أصغر من بعض سلالات الـ E.coli.
Salmonella : مستعمرات زرقاء منبسطة .
Pseudomonas pyocyaneae : مستعمرات خضراء .
Streptococcus fecalis : مستعمرات صفراء بقطر 0.5 ملم .
Staphylococcus aureus : مستعمرات صفراء داكنة بقطر 0.75 ملم .
Coagulase Ve- Staph. :مستعمرات بيضاء معتمة أو صفراء قاتمة ذات حافة شاحبة .
Diphtheroids : مستعمرات رمادية صغيرة جداً .
Lactobacilli : مستعمرات صغيرة جداً رمادية ذات سطح خشن .
بيئة آجار المصل والدكستروز Serum dextrose agar
ببتون 10 جم
مستخلص لحم 5 جم
كلوريد صوديوم 5 جم
آجار 20 جم
ماء مقطر 1 لتر
يعقم بالأوتوكليف ثم يترك ليبرد عند 56 ْم ثم يضاف 5 ملل من المصل المعقم بالترشيح ويحتوي على 20 % ديكستروز إلى 95 ملل من المكونات السابقة ثم تضاف المضادات الحيوية التالية إلى المكونات السابقة ( 1000 ملل من البيئة المحتوية على المصل ) :
6000 u of polymyxin B
25000 u of bacitracin
100 ml.gm of actidione
ويستخدم هذا الوسط لعزل بكتيريا البروسيلا .
ثانيا: ملحق المحاليل والصبغات المستخدمة
محلول كحولي للتعقيم :
يحضر بإضافة 70 ملل من الكحول الإيثيلي إلى 30 ملل من الماء المقطر فيصبح تركيزه 70 % .
محلول اليود لتعقيم الأيدي :
يسحق 2 جرام من اليود Iodine في 100 ملل من الماء المقطر.
صبغة اليود (صبغة جرام) Iodin dye :
يود Iodine 1 جرام
يوديد البوتاسيوم Potasium iodide 2 جرام
ماء مقطر 240 مل
اضافة محلول بيكربونات الصوديوم 5 % بمقدار 60 مل
مزيل اللون ( صبغة جرام ) Decolorizer :
إيثانول 95 % 250 مل
أسيتون 250 مل
صبغة أزرق الميثيلين Methylene blue :
مسحوق أزرق الميثيلين 0.3 جرام
كحول إيثيلي 95% 30 ملل
ماء مقطر 100 ملل
أذب أزرق الميثيلين في الكحول ثم أضف الماء المقطر ورشح المحلول
صبغة السفرانين Safranin (صبغة جرام ) :
مسحوق السفرانين 0.25 جرام
كحول إيثيلي 95% 10 ملل
ماء مقطر 100 ملل
أذب السفرانين في الكحول ثم أضف الماء المقطر ورشح .
صبغة الكريستال البنفسجي Crystal violet أو الجنشيان البنفسجي Gentian violet ( صبغة جرام ) :
n محلول أ
مسحوق الكريستال البنفسجي 4 جرام
كحول إيثيلي 95% 20 ملل
n محلول ب
أكسالات أمونيوم 1 جرام
ماء مقطر 100 ملل
خفف محلول أ عشر مرات بالماء المقطر ثم يخلط محلول أ مع محلول ب بنسبة 1 : 4 .
صبغة ألبرت Albert stain :
أزرق التولويدين Toluidine blue 1.5 جم
أخضر الملاكيت Malachite green 2 جم
حمض الخل acetic acid 10 مل
إيثانول Ethanol 20 مل
ماء مقطر 1000 مل
تذاب الصبغتين بالكحول ثم يضاف الماء وحمض الخل وانتظر لمدة يوم ثم رشح .
الصبغ بطريقة نيسر Neisser`s method :
أزرق الميثيلين Methylene blue 1 جم
إيثانول 95 % 50 مل
حمض الخل Acetic acid 50 مل
ماء مقطر 1000 مل
صبغة لوفلير أزرق الميثيلين Loffler methylene blue stain
Methylene blue 0.3 جم
Ethyl alcohol 95 % 30 مل
D.water 100 مل
يضاف 1 لتر من محلول 0.01 % هيدروكسيد بوتاسيوم KOH إلى 300 مل من المحلول السابق .
صبغة النجروسين Nigrosen :
مسحوق النجروسين 1 جم
ماء مقطر 100 ملل
صبغة أخضر الملاكيت Malchite green :
مسحوق أخضر الملاكيت 5 جم
ماء مقطر 100 ملل
صبغة السفرانين Safranin (صبغ الجراثيم ) :
مسحوق السفرانين 5‚0 جم
ماء مقطر 100 ملل
صبغة الكريستال البنفسجي Crystal violet (صبغة الغلاف ) :
كريستال بنفسجي 1 جم
ماء مقطر 100 ملل
محلول كبريتات النحاس (صبغة الغلاف ) :
كبريتات النحاس 20 جم
ماء مقطر 100 ملل
كحول حامضي Acidic alcohol:
كحول إيثيلي مطلق 95% 97 ملل
حمض هيدروكلوريك مركز 3 ملل
صبغة كربول الفوكسين Carbol fuchsin للصبغ المقاوم للأحماض:
n محلول أ
فوكسين قاعدي 0.3 جم
إيثانول 95% 10 ملل
n محلول ب
فينول 5 جم
ماء مقطر 100 ملل
اخلط المحلولين أ و ب معاً مع أخذ الحذر ويفضل الترشيح قبل الإستخدام .
صبغة أحمر الكونغو Congo red :
مسحوق أحمر الكونغو 3 جم
ماء مقطر 100 ملل
صبغة الروز بنغال Rose bengal :
مسحوق الروز بنغال 1 جم
ماء مقطر 150 ملل
صبغة الإرثروسين :
ارثروسين 1 جم
محلول فينول 5 % 100 مل
كلوريد كالسيوم 0.05 جم
صبغة الأسواط :
محلول ( أ )
حمض تانيك 4 جم
كلوريد حديديك 1.5 جم
ماء مقطر 100 مل
اخلط المكونات السابقة ثم أضف إليها المكونات التالية
هيدروكسيد صوديوم 1 % 1 مل
فورمالين 40 % 2 مل
محلول ( ب )
نترات فضة 2 جم
ماء مقطر 100 مل
أذب نترات الفضة ثم احتفظ بـ 10 مل ثم أضف إلى الـ 90 مل الباقية هيدروكسيد الأمونيوم نقطة نقطة حتى يتكون راسب .
استمر في إضافة هيدروكسيد الأمونيوم نقطة نقطة حتى يزول الراسب ثم توقف عن الإضافة .
ثم أضف محلول نترات الفضة ( 10 مل المحتفظ بها ) إلى المحلول الرئيسي نقطة نقطة حتى تتكون عكارة خفيفة . اختبر الـ Ph واضبطه عند 9.8 – 10 .
يجب إجراء عملية الصبغ خلال 4 ساعات من تجهيز الصبغة .
صبغة فونتانا :
مثبت فونتانا
حمض خليك ثلجي 1 مل
فورمالين 2 مل
ماء مقطر 100 مل
معمق فونتانا
حمض تانيك 5 جم
ماء مقطر 100 مل
محلول فضة فونتانا
1- يذاب 5 جم نترات فضة في 100 مل ماء مقطر .
2- خفف 5 مل من محلول أمونيا مركزة بـ 45 مل ماء مقطر .
3- خذ 90 مل من محلول نترات الفضة وأضف إليه 25 مل من محلول مخفف من الأمونيا
4- استمر في إضافة الأمونيا نقطة نقطة حتى يذوب الراسب المتكون .
5- أضف محلول نترات الفضة ( 10 مل المحتفظ بها ) إلى المحلول الرئيسي نقطة نقطة حتى تتكون عكارة خفيفة .
محلول أحمر الميثايل Methyl red:
أحمر الميثايل 0.1 جم
كحول إيثيلي مطلق 250 مل
ماء مقطر 250 مل
أذب أحمر الميثايل في الكحول ثم أضف إليه الماء ورشح .
محلول ألفانافثايل أمين :
ألفانافثيل أمين 5 مل
حامض كبريتيك مركز 8 مل
ماء مقطر 1 لتر
أضف حامض الكبريتيك المركز إلى الماء المقطر ثم أضف الألفانافثيل أمين وقلب حتى يتم الذوبان .
محلول باريت ( أ )
ألفانافثول 6 جم
كحول إيثيلي مطلق 100 مل
محلول باريت ( ب )
هيدروكسيد بوتاسيوم 16 جم
ماء مقطر 100 مل
حمض بوريك 0.2 جزيئي
بللورات حمض بوريك 12.4 جم
يكمل المحلول بالماء المقطر إلى 1 لتر
حمض ستريك 0.1 جزيئي
حمض ستريك 21 جم
يكمل المحلول بالماء المقطر إلى 1 لتر
حمض سلفانيليك
حمض سلفانيليك 8 جم
حمض كبريتيك مركز 48 مل
يكمل المحلول بالماء المقطر إلى 1 لتر
أضف حمض الكبريتيك إلى 500 مل ماء مقطر ثم أضف حمض السلفانيليك ثم الماء المقطر ليصل الحجم إلى 1000 مل .
فوسفات ثنائي البوتاسيوم 0.2 جزيئي
فوسفات ثنائي البوتاسيوم 34.9 جم
يكمل المحلول بالماء المقطر إلى 1 لتر
محلول كوفاك
بارا داي ميثايل أمينو بنزالدهيد 5 جم
كحول إيثايل أو بيوتايل 75 مل
حمض هيدروكلوريك مركز 25 جم
أذب المادة الأولى في الكحول ثم أضف الحمض .
مزيج فاسبار
فازلين 1 جزء
شمع بارافين 1 جزء
يسخن حتى تنصهر المادتين .
مزيج هضم البروتينات
حمض كبريتيك مركز 500 مل
كبريتات صوديوم 75 جم
سيلينايت النحاس 2 جم
ماء مقطر 500 مل
منظم فوسفاتي
محلول ( أ )
فوسفات أحادي البوتاسيوم 0.91 جم
ماء مقطر 100 مل
محلول ( ب )
فوسفات ثنائي الصوديوم 0.95 جم
ماء مقطر 100 مل
اخلط 61.1 مل من المحلول ب مع 38.9 مل من المحلول أ .
صبغة ليشمان Lieshman stain
تباع كصبغة محضرة وجاهزة إلا أنه من الممكن تحضيرها كما يلي :
تسخن صبغة أزرق الميثيلين ( 2 جم ) مع كربونات الصوديوم 5 % ( 100 ملل ) ثم يترك ليبرد ويضاف له 50 مل من محلول صبغة الإيوسين . وعند الترسيب يؤخذ الراسب ويذاب في كحول ميثيلي .
صبغة جيمسا Giemsa stain
تباع جاهزة ويمكن تحضيرها كما يلي :
جليسرول 25 ملل
أسيتون مطلق 25 ملل
مسحوق صبغة جيمسا 0.3 جم
محلول تنظيف الأدوات الزجاجية :
ثنائي كرومات الصوديوم 25 جم
حمض كبريتيك مركز 1 لتر
ماء مقطر 50 ملل
أولاً: مكونات الأوساط الغذائية:
الوسط الغذائي الآجار المغذي : Nutrient agar
1- ببتون Peptone 6 جم/ل
2- مستخلص خميرة Yeast extract 1 جم/ل
3- مستخلص لحم Beef extract 2 جم/ل
4- كلوريد الصوديوم NaCl 5 جم /ل
5- آجار Agar 17 جم/ل
تذاب هذه المواد في لتر ماء مقطر. D.water 1 لتر
بيئة المرق المغذيNutrient broth :
1- ببتون 5 جم/ل
2- مستخلص لحم 3 جم/ل
3- قد يضاف كلوريد الصوديوم 0.5 جم/ل
تذاب هذه الكميات في لتر من الماء المقطر.
بيئة شابكس دوكس آجارChabex dox agar :
1- ملح كلوريد البوتاسيوم KCl 0.5 جم/ل
2- ملح نترات الصوديوم Na2NO3 2 جم/ل
3- كبريتات المغنيسيوم MgSO4 0.5 جم/ل
4- فوسفات ثنائي هيدروجين البوتاس KH2PO4 1 جم/ل
5- سكروز 10 جم/ل
6- آجــار 17 جم/ل
7- روز بنغال(يستعمل كمضاد لمنع نمو البكتيريا) 10 مل/ل
تضاف هذه الكميات إلى لتر من الماء المقطر.
قد يضاف كبريتات الحديدوز بنسبة 0.01 جم/ ل
بيئة مرق تخمر اللاكتوز Lactose fermentation broth :
1- مستخلص لحم 3 جرام
2- ببتون 5 جرام
3- لاكتوز 5 جرام
4- بروموثيمول الأزرق 0.016
5- ماء مقطر 1 لتر
تعقم البيئة الغذائية تعقيم متقطع
بيئة الجيلاتين المغذي Nutrient gelatin :
مستخلص لحم 3 جرام
ببتون 5 جرام
جيلاتين 150 جرام
ماء مقطر 1 لتر
تعقم البيئة تعقيما متقطعا .
مرق التربتونTrypton broth :
تربتون 10 جرام
مستخلص لحم 3 جرام
ماء مقطر 1 لتر
بيئة الكريستال البنفسجي Crystal violet agar :
تحضر بيئة الآجار المغذي كما سبق ثم يضاف ملل من صبغة الكريستال البنفسجي للوسط الغذائي ثم تعقم البيئة وتحضر صبغة الكريستال البنفسجي كما يلي :
بلورات كريستال بنفسجي 1 جرام
ماء مقطر 100 مل
بيئـة الطحالب:
نترات الكالسيوم Ca(NO3)2 2 جم
كلوريد البوتاسيوم KCl 0.5 جم
كبريتات المغنيسيوم المائي MgSO4 0.5 جم
فوسفات أحادي البوتاسيوم KH2PO4 0.5 جم
ماء الصنبور 1000 ملل
** نخفف جزء واحد من هذا المحلول مع خمسة أجزاء من ماء الصنبور.
كلوريد الحديد المائي FeCl3.6H2O 0.01 جم
بيئة آجار أندو Endo agar :
ببتون 10 جرام
لاكتوز 10 جرام
بوتاسيوم فوسفات الهيدروجين K2HPO4 3.5 جرام
كبريتيد الصوديوم 2.5 جرام
فوكسين قاعدي 0.5 جرام
آجار 15 جرام
ماء مقطر 1 لتر
بيئة آجار ايوسين أزرق اميثيلين ( EMB ) Eosin Methylene bhue agar :
ببتون Peptone 10 جرام
لاكتوز Lactose 5 جرام
سكروز Sucrose 5 جرام
فوسفات ثنائي البوتاسيوم Dipotassium phosphate 2 جرام
ايوسينY Eosin Y 0.4 جرام
أزرق الميثيلين Methylene blue 0.65 جم
آجار Agar 13.5 جرام
ماء مقطر D.water 1 لتر
يمكن زيادة تركيز الآجار في البيئة إلى 5 % ( أي إضافة 17 جم من الآجار بدل الكمية السابقة ) لمنع انتشار Proteus .
بيئة آجار النشا Starch agar :
تربتون 10 جرام
مستخلص خميرة 10 جرام
بوتاسيوم فوسفات الهيدروجين 5 جرام
نشا ذائب 3 جرام
آجار 15 جرام
ماء مقطر 1 لتر
يضاف النشا إلى كمية ماء قليلة ويتم التسخين مع التقليب المستمر حتى يذوب النشا , يستمر التسخين حتى الغليان وبسرعة يتم إضافة النشا الذائب إلى بقية المكونات .
اختبار الاندول , أحمر الميثايل , فوكس بروسكاور , الستراتIMVIC :
اختبار الاندول
تربتون 10 جرام
مستخلص خميرة 5 جرام
بوتاسيوم فوسفات الهيدروجين 5 جرام
جلوكوز 1 جرام
بعد الزراعة والتحضين يتم استخدام طريقة كوفاكس Kovac`s
باضافة 0.3 مل من محلول كوفاكس إلى 6 مل من المزرعة السائلة ثم اخلطهما جيدا فنلاحظ انفصال طبقة كحولية فوق المخلوط ويتحول لون هذه الطبقة إلى اللون الأحمر بعد عدة دقائق في حال وجود الإندول .
ويتركب محلول كوفاكس من :
بارا داي ميثايل امينوبنزالدهيد 5 جرام
كحول أمايل أو بيوتايل 75 مل
حمض هيدروكلوريك مركز 25 مل
تذاب المادة الأولى في الكحول ثم يضاف الحمض بحذر بعد ذلك .
اختبار أحمر الميثايل وفوكس بروسكاور Methyl red voges proskauer medium :
جلوكوز 5 جرام
بروتيوز ببتون 5 جرام
بوتاسيوم فوسفات الهيدروجين 5 جرام
ماء مقطر 1 لتر
Ph = 6.9
يمكن استخدام الببتون باضافة 7 جرام إلى البيئة بدلا من بروتيوز البتون وإضافة الدكستروز 5 جم بدلاً من الجلوكوز . ويستخدم هذا الوسط للإختبارات الكيميائية المفرقة للبكتيريا المعوية.
بيئة آجار الجلوكوز Glucose agar :
1- مستخلص لحم 3 جم
2- ببتون 5 جم
3- جلوكوز 10 جم
4- آجار 17 جم
5- ماء مقطر 1 لتر
بيئة آجار دكستروز البطاطس ( PDA ):
1- مستخلص مائي لـ 200 جم من البطاطس ( يحضر بطهي البطاطس ثم هرسه وتحويله إلى سائل كثيف .
2- دكستروز 20 جم
3- آجار 20 جم
4- ماء مقطر 1 لتر
بيئة آجار أحمر الكونغو :
مانيتول 10 جم
فوسفات ثنائي البوتاسيوم 0.5 جم
كبريتات مغنيسيوم 0.2 جم
كربونات كالسيوم 3 جم
كلوريد صوديوم 0.1 جم
مستخلص خميرة 1 جم
أحمر الكونغو ( 1جم تذاب في 400 مل ) 10 مل
آجار 20 جم
تذاب الكميات في 1 لتر
بيئة أومليانسكي :
كبريتات أمونيوم 1 جم
فوسفات ثنائي البوتاسيوم 1 جم
كبريتات مغنيسيوم 0.5 جم
كربونات كالسيوم 2 جم
كلوريد صوديوم 0.1 جم
ماء مقطر 1 لتر
بيئة قاعدة المرق القرمزي :
1- ببتون 10 جم
2- مستخلص لحم 1 جم
3- كلوريد صوديوم 5 جم
4- برومو كريزول الأرجواني 0.016 جم
5- ماء مقطر 1 لتر
بيئة دايبوز :
1- نترات صوديوم 0.5 جم
2- فوسفات ثنائي البوتاسيوم 1 جم
3- كبريتات مغنيسيوم 0.5 جم
4- كلوريد البوتاسيوم 0.5 جم
5- كبريتات حديديك 0.001 جم
6- ماء مقطر 1 لتر
بيئة كليجلر Kligler agar media :
1- مستخلص لحم 3 جم
2- مستخلص خميرة 3 جم
3- ببتون 15 جم
4- بروتيوز ببتون 5 جم
5- لاكتوز 10 جم
6- جلوكوز 1 جم
7- كبريتات حديدوز 0.2 جم
8- كلوريد صوديوم 5 جم
9- ثيوكبريتات الصوديوم 0.3 جم
10- آجار 15 جم
11- أحمر فينول 0.024 جم
12- ماء مقطر 1 لتر
Salmonella Shigella agar ( S.S.A )
1- مستخلص لحم 5 جم
3- ببتون 5 جم
4- أملاح الصفراء Bile salt mixture 8.5 جم
5- لاكتوز 10 جم
6- سترات الصوديوم 8.5 جم
7- سترات الحديدوز 1 جم
8- أخضر لامع BRILLIANT GREEN 0.33 جم
9- ثيوكبريتات الصوديوم Sodium thiosulfate 8.5 جم
10- آجار 15 جم
11- أحمر فينول Nutral red 0.024 جم
12- ماء مقطر 1 لتر
أذب بالغليان ( لاتستعمل الأوتوكليف ) وتستعمل هذه البيئة لعزل العصيات المعوية الضارة وتمنع نمو بكتيريا Coli form كما تميز بين الأنواع المخمرة للاكتوز وغير المخمرة .
Tetrathionate broth
Proteose peptone 5 gm
Bile salt 1 gm
Calcium carbonate 10 gm
Sodium thiosulphate 30 gm
D.water 1000 ml
وزع 10 مل في كل أنبوب ثم سخن حتى الغليان وقبل الإستعمال يضاف 0.2 مل من محلول اليود إلى كل أنبوب و المحضر كما يلي ( 6 جم يود + 5 جم يوديد البوتاسيوم + 20 مل ماء مقطر ) .
وتستخدم هذه البيئة لعزل السالمونيلا ماعدا Salmonella typhi .
بيئة لبن البروموكريزول الأرجواني :
1- لبن فرز طازج 100 مل
2- بروموكريزول الأرجواني 0.016 جم
تعقم البيئة تعقيماً متقطعاً
مرق دكستروز تريبتون بروموكريزول الأرجواني :
1- تريبتون 10 جم
2- دكستروز 5 جم
3- بروموكريزول الأرجواني 0.04 جم
4- ماء مقطر 1 لتر
بيئة لبن تباع الشمس :
يحضر بإضافة كمية كافية من محلول مائي مشبع من تباع الشمس إلى لبن فرز طازج حتى يصبح اللون أزرق واضح ثم تعقم البيئة تعقيماً متقطعاً .
بيئة مرق النترات Nitrate broth :
1- مستخلص لحم 3 جم
2- ببتون 5 جم
3- نترات بوتاسيوم 1 جم
4- ماء مقطر 1 لتر
أو يمكن استخدام التركيبة التالية لفحص اختزال النترات
Tryptone 5 gm
Neopeptone 5 gm
D.water 1000 ml
Potassium nitrate reagent 1 gm
Glucose 0.1 gm
قبل إضافة المادتين الأخيرتين ( الجلوكوز ونترات البوتاسيوم ) تغلى المواد السابقة واجعل ال ph = 7.3 . ثم توزع 5ملل في أنابيب ثم تعقم لمدة 15 دقيقة .
ويتكون محلول الفحص للنترات من
محلول A : أذب 8 جم من Sulphanilic acid في لتر من 5N acetic acid
محلول B : أذب 5 جم من α-naphthylamine في لتر من 5N acetic acid
Phenylalanin agar
Yeast extract 3 gm
DL-phenylalanin 2 gm
Disodium phosphate 1 gm
NaCl 5 gm
Agar 13 gm
D.water 1000 ml
وزع 3 مل في كل أنبوب ثم عقم عند 121 ْم لمدة 10 دقائق ثم اتركها لتصلب لعمل أنابيب مائلة slant تستخدم هذه البيئة للتأكد من قدرة البكتيريا على إزالة مجموعة الأمين من الحامض الأميني فينيل ألانين وتكوين Phenylpyruvate .
Sabouraud dextrose agar ( SDA )
دكستروز 40 جم
ببتون 10 جم
آجار 15 جم
ماء مقطر 1 لتر
PH 5.4
ويمكن استخدام المكونات الجاهزة كما يلي :
Sabouraud dextrose agar 32.5 gm
Agar 2.5 gm
D.water 500 ml
تذاب هذه المواد وتغلى للتجانس ثم توزع في أنابيب ثم تعقم وهي بوضع مائل لعمل Slant . ويمكن إضافة المضادات الحيوية لها بعد التعقيم . وتستعمل هذه البيئة لتنمية الفطريات . كما يمكن استخدام سكر الجلوكوز أو المالتوز.
بيئة آجار سترات الحديديك ( الكشف عن انتاج كبريتيد الهيدروجين )
1- بروتيوز ببتون 2 جم
2- فوسفات ثنائي البوتاسيوم 0.1 جم
3- سترات الحديديك 0.05 جم
4- آجار 15 جم
5- ماء مقطر 1 لتر
Desoxycholate agar
Peptone 10 gm
Lactose 10 gm
Na.citrate 1 gm
Ferric citrate 1 gm
NaCl 5 gm
Dipotassium phosphate 2 gm
Na-desoxycholate 1 gm
Agar 16 gm
Neutral red 0.033 gm
d.water 1000 ml
تستعمل هذه البيئة لعزل العصويات المعوية السالبة لجرام وللتمييز بين البكتيريا المخمرة لسكر اللاكتوز من غير المخمرة .
Desoxycholate citrate agar ( D.C.A )
Meat infusion form 350 gm
Peptone 10 gm
Lactose 10 gm
Na.citrate 20 gm
Ferric citrate 1 gm
Na-desoxycholate 5 gm
Agar 16 gm
Neutral red 0.02 gm
d.water 1000 ml
ph = 7.3
تستعمل هذه البيئة لعزل السالمونيلا والشايجيلا من البراز أو أي عينة أخرى .
كما يمكن تحضيره بالطريقة التالية :
Meat extract 20 gm
Pepton 20 gm
Lactose 40 gm
Nutral red 0.1 gm
Agar 90 gm
d.water 4 L
يضاف لكل 100 ملل من المكونات السابقة 5 مل من محلول ( أ ) المكون من :
17 % سترات الصوديوم و 17 % ثيوسلفات الصوديوم و 2 % سترات الأمونيوم والحديديك. ثم يضاف 5 ملل من المحلول ( ب ) المكون من 10 % ديسوكسيكولات الصوديوم . وتذاب المكونات بالتسخين على اللهب ولا يعقم بالأوتوكليف ولايتم إذابته مرة أخرى إذا حدث له تصلب .
ويستخدم هذا الوسط لعزل السالمونيلا .
بيئة مرق اليوريا Urea broth :
1- فوسفات ثنائي البوتاسيوم 1 جم
2- كلوريد كالسيوم 0.1 جم
3- كبريتات مغنيسيوم 0.3 جم
4- كلوريد صوديوم 0.1 جم
5- كلوريد حديديك 0.01 جم
6- مستخلص لحم 5 جم
7- يوريا 20 جم
8- ماء مقطر 1 لتر
تذاب اليوريا في 50 مل ماء وتعقم بالترشيح ثم تضاف إلى باقي مكونات البيئة بعد تعقيمها .
كما يمكن تحضير بيئة آجار اليوريا urea agar المستخدمة في اختبار إنزيم اليورييز كما يلي :
Peptone 1 gm
Glucose 1 gm
NaCl 5 gm
Mono-K-phosphate 2 gm
Phenol red 0.012 gm
Agar 20 gm
D.water 1000 ml
Ph = 6.9
تحضر البيئة الأساس وتعقم بالأوتوكلاف لمدة 15 دقيقية في قارورة تحتوي على 100 – 200 مل ثم تحفظ لحين الحاجة .
تحضر اليوريا 29 % محلول اليوريا المعقم بالترشيح ويضاف منه 10 مل من اليوريا / 100 مل من البيئة الأساس المذابة والمبردة لدرجة 50 ْم لعدم تكسر اليوريا بالحرارة العالية ثم توزع بيئة اليوريا في أنابيب بمقدار 3 مل لكل أنبوب وتبرد بشكل مائل حتى تتصلب .
تستعمل هذه البيئة لمعرفة البكتيريا المنتجة لإنزيم اليورييز مثل proteus و Cryptococcus كما يمكن لبعض بكتيريا Coli form إنتاج هذا الإنزيم وتمييزها عن Salmonella , Shigella غير المنتجة للإنزيم .
T.C.B.S ( Thiosulphate citrate bile salt )
Peptone from casien 5 gm
Peptone from meat 5 gm
Yeast extract 5 gm
Sodium citrate 10 gm
Sodium tiosulfate 10 gm
Oxgall 5 gm
Sodium choclate 3 gm
Sucrose 20 gm
NaCl 10 gm
Iron III citrate 1 gm
Thymol blue 0.04 gm
Bromothymol blue 0.04 gm
Agar 14 gm
Ph = 8.8
يستعمل هذا الوسط لتنمية بكتيريا الكوليرا Vibreo cholera.
بيئة مرق ببتون أملاح الصفراء واللاكتوز ودليل الأخضر الزاهي :
1- مستخلص أملاح الصفراء لثور 30 جم
2- لاكتوز 5 جم
3- ببتون 20 جم
4- كلوريد الصوديوم 5 جم
5- أخضر زاهي 1% 2 مل
6- ماء مقطر 1 لتر
مرق خلاصة المالت ( الشعير ) Malt extract broth :
1- مستخلص المالت 20 جم
2- ماء مقطر 1 لتر
يستخدم كوسط عام لنمو الفطريات وخاصة الخمائر ويمكن استخدامه كوسط صلب بإضافة 20 جم من الآجار .
بيئة آجار اختبار الحركة Motility test agar
1- تربتوز 10 جم
2- كلوريد صوديوم 5 جم
3- آجار 5 جم
4- ماء مقطر 1 لتر
بيئة آجار الثيوجليكولات Thioglycolate medium
1- ثيوجليكولات الصوديوم 0.5 جم
2- آجار 20 جم
3- ماء مقطر 1 لتر
كما يمكن استخدام التركيبة التالية :
ببتون 20 جم
ل- سيستين L-cystine 0.25 جم
جلوكوز Glocose 6 جم
كلوريد الصوديوم 2.5 جم
كبريتات الصوديوم Na-sulfate 0.5 جم
كبريتيد الصوديوم Na-sulfite 0.1 جم
آجار 0.7 جم
ماء مقطر 1 لتر
Ph = 7.2
Triple sugar iron agar ( T.S.I )
Peptone 20 gm
NaCl 5 gm
Lactose 10 gm
Sucrose 10 gm
Glucose 1 gm
Ferrous ammonium sulphate 0.2 gm
Na-thiosulphate 0.2 gm
Phenol red 0.025 gm
Agar 13 gm
D.water 1000 ml
Ph = 7.3
تستخدم هذه البيئة لمعرفة تخمر السكريات وإنتاج غاز كبريتيد الهيدروجين H2S للتحقق من وجود العصويات السالبة لصبغة جرام .
بيئة آجار خلاصة الخميرة
1- فوسفات ثنائي البوتاسيوم 2 جم
2- خلاصة اللحم 3 جم
3- خلاصة الخميرة 2 جم
4- تربتون 5 جم
5- جلوكوز 10 جم
6- آجار 15 جم
7- ماء مقطر 1 لتر
بيئة آجار الدم Blood agar
1- مستخلص لحم Beef extract 3 جم
2- تربتوز Treptose 10 جم
3- كلوريد صوديوم NaCl 5 جم
4- آجار Agar 15 جم
5- ماء مقطر D.water 1 لتر
قبل صب البيئة في الأطباق يضاف 5 % دم معقم .
أو يمكن استخدام blood agar base medium ( trypticase soy agar ) 500 ملل يضاف لها دم معقم بالترشيح 20 ملل ( دم أغنام أو خيول )
تعقم بيئة أساس الدم كالمعتاد وتترك لتبرد عند 48 ْم ثم يضاف لها الدم المعقم ويخلط جيداًثم تصب في أطباق وتبرد ويفضل استخدامها قبل أسبوع مع الحفظ الجيد في الثلاجة .
وتعتبر هذه البيئة غنية تشجع نمو البكتيريا ذات الإحتياجات الخاصة . كما يستخدم للتفريق بين البكتيريا المحللة للدم وغير المحللة .
Chocolate agar
تحضر بنفس كميات بيئة آجار الدم مع ملاحظة ما يلي :
بعد تعقيم بيئة blood agar يضاف لها الدم ثم يسخن على اللهب حتى الغليان فيتحول لونها للون البني ( تسخن الكمية على اللهب حتى الغليان ولمدة دقيقة واحدة لتتكسر مكونات خلايا الدم الحمراء وينطلق الهيموجلوبين فيتحول اللون للبني ) .
ثم تصب الأطباق وتبرد وتحفظ في الثلاجة .
Thayer-martin agar
تستعمل هذه البيئة لتنمية بكتيريا Neisseria meningitidis , Neisseria gonorrhoeae وتحضر كما تحضر chocolate agar إلا أنه يضاف لها مضادات حيوية تساعد في قتل الميكروبات الملوثة للعينة الطبية المشتبه وجود بكتيريا Neisseria فيها .
بيئة مرق اختزال الكبريتات
1- كبريتات الأمونيوم 2 جم
2- كبريتات الحديدوز 0.01 جم
3- فوسفات ثنائي البوتاسيوم 0.5 جم
4- لكتات الصوديوم 5 جم
5- ماء مقطر 1 لتر
بيئة مرق النترات
1- ببتون خالي من النترات 1 جم
2- كلوريد الصوديوم 0.5 جم
3- نترات البوتاسيوم 0.5 جم
4- ماء مقطر 1 لتر
بيئة سليولوز الببتون
1- فوسفات ثنائي الأمونيوم 2 جم
2- فوسفات أحادي البوتاسيوم 1 جم
3- كبريتات المغنيسيوم 0.3 جم
4- كلوريد الكالسيوم 0.4 جم
5- كلوريد الحديديك 0.01 جم
6- كربونات الكالسيوم 3 جم
7- ببتون 5 جم
يضاف للبيئة قصاصات ورق ترشيح .
بيئة بورديت جينجس Boredt -gengous medium
مستخلص البطاطس Poteto infusion form 125 جم
NaCl 5.5 جم
آجار 20 جم
ماء مقطر 1 لتر
تعقم هذه البيئة كالمعتاد ثم تبرد عند 50 ْم ثم يضاف لها 15 – 20 % دم معقم وتستعمل هذه البيئة لتنمية بكتيريا Borditella pertussis .
Brain heart infusion broth
Calf brain infusion 200 gm
Beef heart infusion 250 gm
Proteose peptone 10 gm
Dextrose 2 gm
NaCl 5 gm
Na2PO4 2.5 gm
D.water 100 ml
Ph = 7.4
تستعمل هذه البيئة لتنمية Pneumococcus لإجراء اختبار الذوبان في أملاح الصفراء
Bile solubility test .
مرق السيلينايت Selenite broth
Anhydrous sodium hydrogen selenite 4 gm
Disodium hydrogen phosphate 9.5 gm
Sodium hydrogen phosphate 0.5 gm
Pepton 5 gm
Lactose 4 gm
d.water 1 L
يعقم في حمام مائي ولا يستخدم الأوتوكليف ويستخدم هذا الوسط لعزل السالمونيلا من العينات الملوثة من البراو والبول للقضاء على البكتيريا الملوثة للعينة .
Brilliant green agar
Yeast extract 3 gm
Proteose peptone NO.3 10 gm
NaCl 5 gm
Lactose 10 gm
Sacchrose 10 gm
Phenol red 0.08 gm
Brilliant green 0.125 gm
Agar 20 gm
D.water 1000 ml
p.h = 6.9
تستعمل هذه البيئة لتنمية بكتيريا Salmonella ماعدا Salmonella typhi ولا تنمو بكتيريا Shigella على هذه البيئة .
بيئة سيمون Simmon citrate agar
كبريتات المغنيسيوم Magnesium sulfate 0.2 جم
فوسفات الأمونيوم ثنائي الهيدروجين Ammonium phosphate hidrogen 0.2 جم
فوسفات الأمونيوم والصوديوم Ammonium sodium phosphate 0.8 جم
سترات الصوديوم الثلاثية Sodium citrate 2 جم
كلوريد الصوديوم Sodium chloride 5 جم
صبغة أزرق بروموثيمول Bromothymol blue 0.08 جم
آجار Agar 15 جم
ماء مقطر D.water 1 لتر
PH 6.9
يستخدم هذا الوسط للتمييز بين البكتيريا المعوية من حيث استخدام السترات كمصدر للكربون فيحدث تغير للصبغة المضافة في البيئة .
كما يمكن تحضيرها كما يلي :
اختبار السترات Citrate agar :
فوسفات أمونيوم NH4-hydrogen phosphate 1 جرام
فوسفات أحادي البوتاسيوم 1 جرام
كبريتات مغنيسيوم Magnesium sulfate 0.2 جرام
سترات صوديوم Sodium citrate 2 جرام
Bromothymol blue 0.08 جم
NaCl 5 جم
ماء مقطر 1 لتر
آجار Agar 20 جم
Ph = 6.9
يمكن استخدام هذه البيئة سائلة بدون إضافة الآجار وتستخدم للتحقق من استخدام البكتيريا للسترات كمصدر للكربون .
Loffler coagulated serum medium
أضف ثلاث وحدات من مصل الحصان إلى وحدة واحدة من 1% جلوكوز ثم ضع الخليط في أنبوب وسخن لمدة ساعتين عند 75 – 85 ْم ( كرر عملية التسخين 3 أيام متتالية ) ثم عقم بالأوتوكليف لمدة 15 دقيقة حتى تتجلط البيئة .
أخرج الهواء بالتدريج حتى تحافظ على الضغط داخل الجهاز ثم عقم بالأوتوكليف مرة أخرى عند 121 ْم لمدة 15 – 20 دقيقة .
Lowenstein-jensen medium ( L.J )
Salt solution
Monopotassium phosphate 2.4 gm
Magnesium sulfate 7H2O 0.24 gm
Magnesium citrate 0.6 gm
Asparagin 3.6 gm
Glycerol reagent grade 1 12 ml
D.water 600 ml
Poteto flour 30 gm
Homogenized whole egg 1000 ml
Malachite green 2% aqueous 20 ml
أضف مسحوق البطاطس إلى قارورة المحلول الملحي وعقم بالأوتوكليف لمدة 30 دقيقة ثم اغسل بيض طازج بعمر أقل من أسبوع بـ 5 % محلول صابون وضع البيض فيه لمدة 30 دقيقة ثم ضعها في الماء الجاري حتى تصبح صافية ثم اغمرها في 70 % كحول لمدة 15 دقيقة ثم اكسرها وضعها في قارورة معقمة واخلطها جيداً حتى تتجانس مكوناتها ثم صفي المحلول بشاش معقم أربع طبقات . ثم أضف لتراً من خليط البيض المتجانس إلى القارورة المحتوية على المحلول الملحي ومحلول البطاطس ثم أضف كمية محلول أخضر المالاكيت للقارورة واخلطه جيداً .
وزع البيئة في أنابيب اختبار معقمة في كل أنبوب 6 مل ثم كثف الأنابيب على درجة 85 ْم لمدة 50 دقيقة يفضل فحص الأنابيب بوضع أحدها في الحضان لمدة 48 ساعة خشية حدوث تلوث بها ويمكن حفظها في الثلاجة لفترة شهر .
وتستعمل هذه البيئة لتنمية Mycobacterium tuberculosis .
Macconkey agar
Peptone 17 gm
Proteose peptone 3 gm
Lactose 10 gm
Bile salt 1.5 gm
NaCl 5 gm
Agar 15 gm
Neutral red 0.03 gm
Crystal violet 0.001 gm
D.water 1000 ml
يعتبر وسط مفرق بين البكتيريا المخمرة لسكر اللاكتوز وغير المخمرة بحيث تظهر البكتيريا المخمرة للاكتوز مستعمرات وردية بينما غير المخمرة تظهر مستعمرات شفافة وهذه البيئة تظهر البكتيريا المعوية coli form . يمكن زيادة 3.5 جم للبيئة لمنع انتشار بكتيريا Proteus .
Sensitivity test agar ( Muller – Hinton )
Pancreatic digest of casien 2 gm
Peptic of animal tissue 7 gm
Veal infusion 9 gm
Dextrose 10 gm
NaCl 3 gm
Disodium phosphate 2 gm
Sodium acitate 1 gm
Adinine sulfate 0.01 gm
Guanine 0.01 gm
Uracil 0.01 gm
Xanthine 0.01 gm
Agar 14 gm
Ph = 7.3
تستعمل هذه البيئة لفحص حساسية البكتيريا للمضادات الحيوية .
CLED Medium ( Mackey & Sandys )
The cystine – lactose – electrolytes – deficient medium
Peptone 4 gm
Beef extract 3 gm
Tryptone 4 gm
Lactose 10 gm
L-cystine 0.128 gm
Bromothymol blue 0.2 gm
D.water 1000 ml
Ph = 7.3
تعطي هذه البيئة الصفات التالية لكل نوع من البكتيريا :
E.coli : مستعمرات صفراء معتمة وتظهر سلالات الـ E.coli غير المخمرة للاكتوز زرقاء اللون .
Klebsiella : مستعمرات مخاطية بلون أصفر- أبيض مزرق .
Proteus : مستعمرات زرقاء أصغر من بعض سلالات الـ E.coli.
Salmonella : مستعمرات زرقاء منبسطة .
Pseudomonas pyocyaneae : مستعمرات خضراء .
Streptococcus fecalis : مستعمرات صفراء بقطر 0.5 ملم .
Staphylococcus aureus : مستعمرات صفراء داكنة بقطر 0.75 ملم .
Coagulase Ve- Staph. :مستعمرات بيضاء معتمة أو صفراء قاتمة ذات حافة شاحبة .
Diphtheroids : مستعمرات رمادية صغيرة جداً .
Lactobacilli : مستعمرات صغيرة جداً رمادية ذات سطح خشن .
بيئة آجار المصل والدكستروز Serum dextrose agar
ببتون 10 جم
مستخلص لحم 5 جم
كلوريد صوديوم 5 جم
آجار 20 جم
ماء مقطر 1 لتر
يعقم بالأوتوكليف ثم يترك ليبرد عند 56 ْم ثم يضاف 5 ملل من المصل المعقم بالترشيح ويحتوي على 20 % ديكستروز إلى 95 ملل من المكونات السابقة ثم تضاف المضادات الحيوية التالية إلى المكونات السابقة ( 1000 ملل من البيئة المحتوية على المصل ) :
6000 u of polymyxin B
25000 u of bacitracin
100 ml.gm of actidione
ويستخدم هذا الوسط لعزل بكتيريا البروسيلا .
ثانيا: ملحق المحاليل والصبغات المستخدمة
محلول كحولي للتعقيم :
يحضر بإضافة 70 ملل من الكحول الإيثيلي إلى 30 ملل من الماء المقطر فيصبح تركيزه 70 % .
محلول اليود لتعقيم الأيدي :
يسحق 2 جرام من اليود Iodine في 100 ملل من الماء المقطر.
صبغة اليود (صبغة جرام) Iodin dye :
يود Iodine 1 جرام
يوديد البوتاسيوم Potasium iodide 2 جرام
ماء مقطر 240 مل
اضافة محلول بيكربونات الصوديوم 5 % بمقدار 60 مل
مزيل اللون ( صبغة جرام ) Decolorizer :
إيثانول 95 % 250 مل
أسيتون 250 مل
صبغة أزرق الميثيلين Methylene blue :
مسحوق أزرق الميثيلين 0.3 جرام
كحول إيثيلي 95% 30 ملل
ماء مقطر 100 ملل
أذب أزرق الميثيلين في الكحول ثم أضف الماء المقطر ورشح المحلول
صبغة السفرانين Safranin (صبغة جرام ) :
مسحوق السفرانين 0.25 جرام
كحول إيثيلي 95% 10 ملل
ماء مقطر 100 ملل
أذب السفرانين في الكحول ثم أضف الماء المقطر ورشح .
صبغة الكريستال البنفسجي Crystal violet أو الجنشيان البنفسجي Gentian violet ( صبغة جرام ) :
n محلول أ
مسحوق الكريستال البنفسجي 4 جرام
كحول إيثيلي 95% 20 ملل
n محلول ب
أكسالات أمونيوم 1 جرام
ماء مقطر 100 ملل
خفف محلول أ عشر مرات بالماء المقطر ثم يخلط محلول أ مع محلول ب بنسبة 1 : 4 .
صبغة ألبرت Albert stain :
أزرق التولويدين Toluidine blue 1.5 جم
أخضر الملاكيت Malachite green 2 جم
حمض الخل acetic acid 10 مل
إيثانول Ethanol 20 مل
ماء مقطر 1000 مل
تذاب الصبغتين بالكحول ثم يضاف الماء وحمض الخل وانتظر لمدة يوم ثم رشح .
الصبغ بطريقة نيسر Neisser`s method :
أزرق الميثيلين Methylene blue 1 جم
إيثانول 95 % 50 مل
حمض الخل Acetic acid 50 مل
ماء مقطر 1000 مل
صبغة لوفلير أزرق الميثيلين Loffler methylene blue stain
Methylene blue 0.3 جم
Ethyl alcohol 95 % 30 مل
D.water 100 مل
يضاف 1 لتر من محلول 0.01 % هيدروكسيد بوتاسيوم KOH إلى 300 مل من المحلول السابق .
صبغة النجروسين Nigrosen :
مسحوق النجروسين 1 جم
ماء مقطر 100 ملل
صبغة أخضر الملاكيت Malchite green :
مسحوق أخضر الملاكيت 5 جم
ماء مقطر 100 ملل
صبغة السفرانين Safranin (صبغ الجراثيم ) :
مسحوق السفرانين 5‚0 جم
ماء مقطر 100 ملل
صبغة الكريستال البنفسجي Crystal violet (صبغة الغلاف ) :
كريستال بنفسجي 1 جم
ماء مقطر 100 ملل
محلول كبريتات النحاس (صبغة الغلاف ) :
كبريتات النحاس 20 جم
ماء مقطر 100 ملل
كحول حامضي Acidic alcohol:
كحول إيثيلي مطلق 95% 97 ملل
حمض هيدروكلوريك مركز 3 ملل
صبغة كربول الفوكسين Carbol fuchsin للصبغ المقاوم للأحماض:
n محلول أ
فوكسين قاعدي 0.3 جم
إيثانول 95% 10 ملل
n محلول ب
فينول 5 جم
ماء مقطر 100 ملل
اخلط المحلولين أ و ب معاً مع أخذ الحذر ويفضل الترشيح قبل الإستخدام .
صبغة أحمر الكونغو Congo red :
مسحوق أحمر الكونغو 3 جم
ماء مقطر 100 ملل
صبغة الروز بنغال Rose bengal :
مسحوق الروز بنغال 1 جم
ماء مقطر 150 ملل
صبغة الإرثروسين :
ارثروسين 1 جم
محلول فينول 5 % 100 مل
كلوريد كالسيوم 0.05 جم
صبغة الأسواط :
محلول ( أ )
حمض تانيك 4 جم
كلوريد حديديك 1.5 جم
ماء مقطر 100 مل
اخلط المكونات السابقة ثم أضف إليها المكونات التالية
هيدروكسيد صوديوم 1 % 1 مل
فورمالين 40 % 2 مل
محلول ( ب )
نترات فضة 2 جم
ماء مقطر 100 مل
أذب نترات الفضة ثم احتفظ بـ 10 مل ثم أضف إلى الـ 90 مل الباقية هيدروكسيد الأمونيوم نقطة نقطة حتى يتكون راسب .
استمر في إضافة هيدروكسيد الأمونيوم نقطة نقطة حتى يزول الراسب ثم توقف عن الإضافة .
ثم أضف محلول نترات الفضة ( 10 مل المحتفظ بها ) إلى المحلول الرئيسي نقطة نقطة حتى تتكون عكارة خفيفة . اختبر الـ Ph واضبطه عند 9.8 – 10 .
يجب إجراء عملية الصبغ خلال 4 ساعات من تجهيز الصبغة .
صبغة فونتانا :
مثبت فونتانا
حمض خليك ثلجي 1 مل
فورمالين 2 مل
ماء مقطر 100 مل
معمق فونتانا
حمض تانيك 5 جم
ماء مقطر 100 مل
محلول فضة فونتانا
1- يذاب 5 جم نترات فضة في 100 مل ماء مقطر .
2- خفف 5 مل من محلول أمونيا مركزة بـ 45 مل ماء مقطر .
3- خذ 90 مل من محلول نترات الفضة وأضف إليه 25 مل من محلول مخفف من الأمونيا
4- استمر في إضافة الأمونيا نقطة نقطة حتى يذوب الراسب المتكون .
5- أضف محلول نترات الفضة ( 10 مل المحتفظ بها ) إلى المحلول الرئيسي نقطة نقطة حتى تتكون عكارة خفيفة .
محلول أحمر الميثايل Methyl red:
أحمر الميثايل 0.1 جم
كحول إيثيلي مطلق 250 مل
ماء مقطر 250 مل
أذب أحمر الميثايل في الكحول ثم أضف إليه الماء ورشح .
محلول ألفانافثايل أمين :
ألفانافثيل أمين 5 مل
حامض كبريتيك مركز 8 مل
ماء مقطر 1 لتر
أضف حامض الكبريتيك المركز إلى الماء المقطر ثم أضف الألفانافثيل أمين وقلب حتى يتم الذوبان .
محلول باريت ( أ )
ألفانافثول 6 جم
كحول إيثيلي مطلق 100 مل
محلول باريت ( ب )
هيدروكسيد بوتاسيوم 16 جم
ماء مقطر 100 مل
حمض بوريك 0.2 جزيئي
بللورات حمض بوريك 12.4 جم
يكمل المحلول بالماء المقطر إلى 1 لتر
حمض ستريك 0.1 جزيئي
حمض ستريك 21 جم
يكمل المحلول بالماء المقطر إلى 1 لتر
حمض سلفانيليك
حمض سلفانيليك 8 جم
حمض كبريتيك مركز 48 مل
يكمل المحلول بالماء المقطر إلى 1 لتر
أضف حمض الكبريتيك إلى 500 مل ماء مقطر ثم أضف حمض السلفانيليك ثم الماء المقطر ليصل الحجم إلى 1000 مل .
فوسفات ثنائي البوتاسيوم 0.2 جزيئي
فوسفات ثنائي البوتاسيوم 34.9 جم
يكمل المحلول بالماء المقطر إلى 1 لتر
محلول كوفاك
بارا داي ميثايل أمينو بنزالدهيد 5 جم
كحول إيثايل أو بيوتايل 75 مل
حمض هيدروكلوريك مركز 25 جم
أذب المادة الأولى في الكحول ثم أضف الحمض .
مزيج فاسبار
فازلين 1 جزء
شمع بارافين 1 جزء
يسخن حتى تنصهر المادتين .
مزيج هضم البروتينات
حمض كبريتيك مركز 500 مل
كبريتات صوديوم 75 جم
سيلينايت النحاس 2 جم
ماء مقطر 500 مل
منظم فوسفاتي
محلول ( أ )
فوسفات أحادي البوتاسيوم 0.91 جم
ماء مقطر 100 مل
محلول ( ب )
فوسفات ثنائي الصوديوم 0.95 جم
ماء مقطر 100 مل
اخلط 61.1 مل من المحلول ب مع 38.9 مل من المحلول أ .
صبغة ليشمان Lieshman stain
تباع كصبغة محضرة وجاهزة إلا أنه من الممكن تحضيرها كما يلي :
تسخن صبغة أزرق الميثيلين ( 2 جم ) مع كربونات الصوديوم 5 % ( 100 ملل ) ثم يترك ليبرد ويضاف له 50 مل من محلول صبغة الإيوسين . وعند الترسيب يؤخذ الراسب ويذاب في كحول ميثيلي .
صبغة جيمسا Giemsa stain
تباع جاهزة ويمكن تحضيرها كما يلي :
جليسرول 25 ملل
أسيتون مطلق 25 ملل
مسحوق صبغة جيمسا 0.3 جم
محلول تنظيف الأدوات الزجاجية :
ثنائي كرومات الصوديوم 25 جم
حمض كبريتيك مركز 1 لتر
ماء مقطر 50 ملل