الpcr [الأرشيف] - منتدى زراعة نت

hamshari

08-03-2009, 02:18 PM

fكلية التربية
جامعة عين شمس
قسم العلوم البيولوجية و الجيولوجية

عمل الطالبة : ميادة عبد الوهاب محمد .
الفرقة : الثالثة.
شعبة : العلوم البيولوجية و الجيولوجية عربى .
تحت اشراف: د. حسام حمدى .

العام الدراسى
2008-2007
Mayada_abdemlwahab[at]yahoo.com

ان عملية النسخ و الاستنساخ هى عملية موجودة فى الحياة الطبيعية منذ ملايين السنين و نجدهذا مثلا فى مستعمرة البكتيريا فهى تظهر الى الوجود بالاستنساخ لان كل فرد فى هذه المستعمرة قد استنسخ من خلية بكتيرية وحيدة و هذه العملية يطلق عليها العلماء الانشطار Fission حيث ان كل فرد حدث له انشقاق جسدى وهى احدى طرق التكاثر الطبيعية التى ينتج بها الافراد مشابهين للاباء تماما .
و اذا دخلنا عالم الحيوان نجد بعض الحيوانات كالاسفنج و الهيدرا يتكاثر لاجنسى لانتاج فرد مستنسخ .
و ايضا بعض الحشرات يتكاثر عذريا مثل النحل و الدبابير و المن دون ان يلقحها الذكر ويخرج منها افراد مشابهة لشخصها.
ايضا التوائم المتماثلة ما هى الا عملية استنساخ لكنها طبيعية دون تدخل الانسان فيها .
بدأ علم الهندسة الوراثية من دراسة الفيروسات التي تنمو في داخل سلالات معينه من بكتريا الـ E. coliوالتي يقتصر نموها على هذه السلالات فقط و لا تستطيع ان تنمو داخل سلالات اخرى. هذا الآمر أرجعه العلماء إلي إن السلالات المقاومة من البكتريا تقوم بتكوين أنزيمات تتعرف على مواقع معينه على جزئ الـ DNA الفيروسي الغريب وتقوم بهضمه إلي قطع عديمة القيمة , هذه الأنزيمات أطلق عليها أنزيمات القطع المحددة Restriction Enzymes ومن المعروف إن الفيروس يحتوى على DNA والبكتريا أيضا تحتوى على DNA .إذن لماذا تهاجم أنزيمات القطع المحددة Restriction Enzymes , DNA الفيروسي ولا تهاجم DNA البكتيريا ؟ وجد الباحثون إن البكتريا لكي تحافظ على DNA الخاص بها حيث تضيف مجموعه ميثيل إلي النيوكليوتيدات في مواقع جزى DNA البكتيري التي تتماثل مع مواقع التعرف على DNA الفيروسي مما يجعل DNA البكتيري مقاوما لفعل هذا الأنزيم . وقد تم بالفعل فصل ما لا يزيد على 250 أنزيما من سلالات بكتيرية مختلفة كالأنزيم من هذه الأنزيمات يقوم بالتعرف على تتابع معين من النيوكليوتيدات حيث يقوم الأنزيم بقص جزئ DNA عند موقع التعرف .

الاستنساخ هو عملية لاجنسية لتكثير كائنات متطابقة وراثيا
وفيه يستخدم العلماء ما هو موجودا بالفعل اى انه عملية تكاثر لشئ موجود ويعتبر بداية الثورة االاجنسية .

استنساخ جينى .
استنساخ جسدى .
و سوف نتكلم عن الاستنساخ الجينى و مميزاته .

تحتوى الخلية على الالاف من الجينات المختلفة ممثلة باعداد مختلفة فى خليط معقد . فمثلا بعض الجينات ممثلة بعدد قليل من النسخ و بعضها ربما يصل الى الاف النسخ .

و للحصول على جين معين بصورة نقية و باعداد كبيرة من النسخ نقوم باستنساخ ذلك الجين.
و يتم استنساخ الجين لعدة اغراض منها معرفة تركيب الجين او تسلسل النيوكليتيدات فى ذلك الجين و دراسة وظيفته و ربما استعماله لانتاج بروتينات لاستعمالها كادوية مثل الانسولين و عامل التخثر الدموى وغيرها

نسخ أو استنساخ القطع من الدي إن أي عن طريق الهندسة الوراثية.
إن ما يهتم به العلماء في باب الاستنساخ هو نسخ قطع منDNA سواء كانت هذه القطع عبارة عن جين(مورث)أو جميع الجينوم(أي كل الدي إن أي الموجود في الكائن الحي).و اشهر العمليات التي تجرى هي نسخ قطعة منDNA. و يحتاج العلماء للقيام بنسخ القطع لأنهم يحتاجون إلى كمية كبيرة من هذه النسخ و ذلك لندرة استخلاصها في كل مرة من داخل الخلية و ذلك لوجود التعقيدات الإنشائية للكروموسومات .و على سبيل المثال فان الجين المنتج لسلسة بيتا في الهيموجلوبين و المعروف بمورث ببيتا جلوبين( Beta-Globin Gene) يمثل فقط 0.00005% من حجم الدي إن أي الكلي في الخلية(و الذي يتراوح ب 3بلايين قاعدة نووية).كما أن الجين العملاق و المعروف بجين الدستروفين( Dystrophin Gene ) و الذي يتراوح حجمه بال2.5 ميقابيز (2.5Megabases ) لا يمثل أكثر من 0.08% من الحجم الكلي DNAالخلية.و لذلك فان العلماء يحتاجون إلى إجراء نسخ لهذه الجينات أو القطعة من الدي إن أي لكي يتسنى لهم التعامل بها و إجراء التجارب عليها.و هناك طريقتان رئيسيتان للنسخ:
1- النسخ عن طريق استخدام الخلايا الحية(Cell-Based DNA cloning)
2- النسخ عن طريق الخلايا غير الحية(Cell-Free DNA cloning) و ذلك باستخدام البي سي أر( Polymerase chain reaction PCR).
النسخ عن طريق استخدام الخلايا (Cell-Based DNA cloning)
يرتكز النسخ باستخدام الخلايا الحية على ثلاث خطوات:

1- تصميم قطعة مهجنة من DNAالمراد نسخها وDNAمن ناقل (Vector) و لدية القدرة على التكاثر.و ذلك عن طريق استخدام الإنزيمات القاطعة(Restriction enzymes).

1- Construction of recombinant DNA molecules by in Vitro attachment to Replicon(Vector).

2- نقل القطعة المهجنة و التي هي بداخل الناقل إلى خلية حية و في العادة تستخدم البكتيريا(Bacteria ) خاصة النوع المعروف بالايكولي ((E,coli او الخميرة Yeast)).

2-Transformation using bacteria or yeast

3- اختيار المستعمرات البكتيرية التي تحتوي على الناقل و القطعة المهجنة و السماح لها بالتكاثر.عن طريق أطباق الزراعة(Culture Plates) أو في محاليل سائلة.

3- Selective propagation of cell clones.

4-استخلاص القطع المهجنة و استخراج DNA منها بكميات كبيرة.

3- Isolation of recombinant DNA clones
1- تصميم القطع مهجنة DNA
يعتمد النسخ باستخدام الخلايا الحية على قدرة القطعة المراد نسخها على الانقسام أو التكاثر الذاتي عندما توضع داخل الخلية الحية.و لا شك أن قطع DNAالعادية ليس لديها القدرة على التكاثر الذاتي و لذلك فان العلماء قاموا بتجاوز هذا الأمر بان ادخلوا القطعة التي يريدون نسخها في ناقل من النواقل( Vectors ) المعروفة بقدرتها على التكاثر الذاتي و بغض النظر عن نوع الناقل فان طريقة إدخال قطعة الدي ان أي المراد نسخها إلى الناقل تقريبا واحدة.و هذه الخطوات ببساطة كما يلي:
1- بعد أن يتم تحديد القطعة المراد نسخها يضاف إليها إنزيم قاطع محدد و ليكن مثلا إنزيم ( أ )فيقوم هذا الإنزيم بقطع الدي إن أي في مكان محدد حسب التسلسل النووي.
2- يضاف نفس الإنزيم للناقل و الذي يقوم بقطعة أيضا في نفس التسلسل النووي.
3- تضاف القطع المراد نسخها بعد قطعها بالإنزيم القاطع إلى الناقل المقطّع. فتتداخل التسلسلات النووية بين الناقل و بين قطع DNAالمراد نسخها. فنشاء من ذلك قطعة مهجنة من الناقل و بداخله القطعة المراد نسخها.و ترتبط قطعة DNA بالبلازميد من أطرافها برابطة هيدروجينية و هي رابطة ضعيفة لذلك يضاف إنزيم يسمى ليقيز أو اللاصق(Ligase ) لكي يحول الترابط بين قطعة DNAو الناقل إلى رابطة قوية(Covalent Bond )
إن أكثرالناقلات استخداما هي البلازميد و لكن يمكن استخدام الفيج أو الياك أو أي ناقل أخر.و الذي يحدد نوع الناقل المراد استخدامه هو في العادة كبر القطعة المراد استنساخها.ففي حالة القطع الصغيرة يستخدم البلازميد أو الفيج بينما يستخدم الياك أو الباك في حالة القطع الكبيرة.
2- نقل القطعة المهجنة و التي هي بداخل الناقل إلى خلية حية
في الغالب تستعمل البكتيريا خاصة النوع المعروف الايكولي(E.Coli) في عملية الزراعة و ذلك لسهولة إدخال الناقل إليها، و إلى سرعة انقسامها (تنقسم البكتريا تقريبا كل 20 دقيقة)، إضافة إلى توفر طرق الاختيار خاصة التي تعتمد على خاصة الحماية من المضادات الحيوية.و يدخل البلازميد أو الفيج تلقائيا إلى داخل البكتيريا بينما الناقلات الأخرى تحتاج إلى مساعدة ،و في العادة بتغيير تركيز الأملاح المحيطة بالبكتيريا أو تعرض إلى نبضة كهربائية لكي يسمح الجدار المحيط بالبكتيريا بدخول الناقلات.و من طبيعة البكتريا إنها تنقسم تلقائيا و بشكل سريع و كذلك البلازميدات.
3- اختيار المستعمرات البكتيرية التي تحتوي على الناقل و القطعة المهجنة
مع تكاثر الخلايا البكتيرية و تكاثر البلازميد التي بداخلها ينتج لدينا أعداد كثيرة من المستعمرات البكتيرية و بها البلازميد المهجن.و لكن قد يكون في داخل الطبق الذي زرع فيه البكتريا بعض البكتريا التي لا تحتوي على البلازميد المهجن و لكي يمكن التعرف على البكتيريا التي تحتوي على البلازميد المهجن فانه في العادة يقام باستعمال ناقلات عليها جينات واقية من المضادات الحيوية، كالجين الواقي من المضاد الحيوي امبيسيلين أو لاتترسيلين و غيرها. و بذلك فالمضاد الحيوي سوف يمنع تكاثر أي خلية بكتيرية لا تحتوي على البلازميد المهجن و الذي علي الجين الواقي من المضاد الحيوي.
4- استخلاص القطع المهجنة و استخراج DNAمنها بكميات كبيرة.
بعد أن يُتعرف على المستعمرات التي تحتوي على البلازميد المهجن فانه يمكن نقلها إلى طبق جديد و يحافظ عليها و تغذى لكي تستمر بالتكاثر.و هذه البكتيريا يكون فيها أعداد كثيرة من البلازميد و بذلك تنتهي عملية النسخ.و يستفاد من هذه القطع المنسوخة في القيام بالمزيد من البحوث أو التجارب عليها كان يقام مثلا إنتاج مكتبة من DNAأو محاولة استنتاج التسلسل النووي للقطعة.كما يمكن تحوير هذه العملية بحيث يحتوي البلازميد على قطعة من سي دي إن أي(cDNA) بدل و من ثم تحوير المراحل الأخيرة من الزراعة لإنتاج بروتين بدلا من ال DNA. و هذه الطريقة هي التي تستعمل في إنتاج بعض الهرمونات

مميزات الاستنساخ
استطاع العلماء قطع اجزاء من جينات الانسان و ترتيب شفرات الحمض النووى ثم انتاجها معمليا .
امكن ادخال هذه الجينات الادمية الى كائنات دقيقة هى البكتيريا E coli لتقوم بانتاج بروتين من اصل ادمى (وتسمى هذه العملية بالحمض النووى المهجن) .
استخدمت هذه البكتيريا كمصانع بيولوجية لانتاج الهرمونات و البروتينات العديدة لاغراض الصناعات الطبية مثل انتاج هرمون النمو و الانسولين من اصل ادمى .
اصبحت الهندسة الوراثية مصدرا لانتاج المستحضرات المناعية التشخيصية و العلاجية .
اسهمت تقنيات الهندسة الوراثية فى التشخيص الدقيق و الاكيد لكثير من الامراض الوراثية .
استخدمت فى علاج السرطان .
انتاج فاكسينات لكثير من الامراض الفيروسية مثل التهاب الكبد الوبائى B.
انتاج انواع من الالبان فى الحيوانات المخلطة جينيا .و يعالج هذا اللبن احد امراض المناعة التى ليس لها علاج من قبل و تعقبها عادة الوفاة سريعا وذلك لاحتوائه على مضاد الالفا تربسين و يسمى Mucoviscidose .
انتاج انواعا من البروتين لها خصائص طبية مميزة .

وكان قبل استخدام طرق الهندسة الوراثية كان يتم استخلاص بعض الهرمونات مثل الانسولين الذى يستخدم فى علاج السكر من بنكرياس الخنازير و الماشية .
كما كان يستخلص هرمون النمو الذى يعالج بعض انواع قصر القامة من الغدة النخامية من جثث الموتى و كان ما يستخلص من 50جثة يكفى لعلاج شخص واحد بالاضافة الى خطورة ماتحمله هذه الخلاصة من فيروسات بطيئة تسبب امراضا عصبية مزمنة فى الانسان .

اما الان بعد استخدام طرق الهندسة الوراثية اصبح ممكنا تحضير هذه الهرمونات بواسطة البكتيريا المعوية E coli حيث يمكن استعمال الجين الادمى الذى ينتج عن هذه الهرمونات و هذا باستخدام خلايا البكتيريا مصانع لانتاج هذه الهرمونات و بهذا اصبح انتاج هذه الهرمونات على درجة عالية من النقاء و الفاعلية و اكثر توافرا و اكثر امانا .
كما امكن باستخدام هذه الطريقة من انتاج مادة الانترفيرون الادمى فى البكتيريا المعوية و بذلك امكن انتاج كميات كبيرة من هذه المادة البروتينية المهمة التى يفرزها الجهاز المناعى فى جسم الانسان وهذه المادة تنقسم الى 3 انواع الفا و بيتا و جاما و تستخدم فى علاج بعض الامرض الفيروسية و السرطان و كان استخلاص 0.1 جرام من الانترفيرون يستلزم 50 لتر من الم الادمى و الانترفيرون النقى المتوفر حاليا يرجع الى استخدام طرق الهندسة الوراثية فى انتاجه .

اولا الكتب
الاستنساخ و الانجاب بين تجريب العلماء و تشريع السماء
للدكتور :كارم السيد غنيم .
استاذ بكلية العلوم جامعة الازهر .
استنساخ الانسان حيا و ميتا
د . سينوت حليم دوس .

ثانيا المواقع
http://www.werathah.com/learning/cell_cloning.htm
ttp://www.almadapaper.com/sub/06-138/p08.htm http://forum.egypt.com/arforum/archive/index.php/t-5254.htm